萬薇 余蓉 江紅群
南昌大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南昌330006)
耳聾(Hearing loss,HL)是指不同程度的聽力損失,是人類最常見的先天性感覺障礙之一,先天性聽力損失的發(fā)生概率大約為1‰-3‰[1,2]。雖然HL可歸因于多種因素,但遺傳因素仍可占50-60%[3],根據相關文獻報道,約30%的遺傳性HL屬于綜合征性耳聾(Syndromic hearing loss,SHL),另有70%屬于非綜合征性耳聾(Nonsyndromic hearing loss,NSHL)[4,5],且大部分的NSHL符合孟德爾遺傳方式,即通常由單個基因突變導致耳聾。目前已經明確了有超過140個位點與HL相關,在我國HL的相關流行病學調查顯示,主要的基因突變發(fā)生在GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA和GJB3基因上。
隨著分子生物學研究的不斷進展及優(yōu)生優(yōu)育理念不斷深入,耳聾基因檢測可以幫助了解檢測者及其家庭所攜帶的基因類型,特別是對于那些具有HL家族史或已經生育HL患兒或合并單基因疾病的夫婦,必要的產前診斷(Prenatal diagnosis,PD)可有效減少遺傳性HL兒童的出現[6,7]。本研究旨在通過對HL高危家庭進行遺傳性HL熱點基因突變篩查,明確突變的攜帶情況,為受檢者的婚育遺傳咨詢與干預措施提供依據,評估其預防耳聾出生缺陷的臨床意義。
回顧性研究2019年1月至6月于我科門診就診及參與我省重度聾兒救治康復項目“七彩夢計劃”的72個耳聾高危家庭。對于每一個家庭中的先證者通過分析他們聽力障礙的起始年齡及進展情況,是否存在誘因,有無耳毒性藥物應用史及噪聲接觸史,相關的聽力學和顳骨高分辨CT等影像學檢查,行全身體檢排除SHL,詳細詢問家族史,以確診為NSHL。對于每個家庭中的非聾人,詳細詢問有無耳鳴、眩暈等癥狀,既往有無其他系統(tǒng)性疾病及聽力學檢查情況。對于HL高危家庭的納入標準:①夫妻有一方或者雙方為有聽力障礙的殘疾人;②夫妻雙方無聽力障礙但直系親屬中有聽力障礙;③已生育有聽力障礙的兒童家庭。
1.2.1 外周靜脈血采集
參與本研究之前充分告知所有受檢者或監(jiān)護人耳聾基因篩查的目的、意義及方法,篩查的優(yōu)勢及局限性,取得所有家庭的書面知情同意書,并建立耳聾基因檔案。抽取外周靜脈血2~3 ml,EDTA抗凝。
1.2.2 耳聾基因檢測
使用使用耳聾易感基因檢測試劑盒(廣東凱普生物科技股份有限公司生產,中國)進行相關基因組DNA提取,通過PCR及導流雜交法對4個熱點基因GJB2、GJB3、SLC26A4、線粒體12S rRNA中的9個位點進行檢測,包括:GJB2基因的35delG、176del16、235delC、299_300delAT,GJB3基因的538C>T,SLC26A4基因的2168A>G、919-2A>G和線粒體12SrRNA基因的1494C>T、1555 A>G進行基因突變檢測。(1)PCR:在模板加樣區(qū)內,向相對應的A、B系列試劑中分別加入2μl同一樣本核酸溶液,配置成2μl反應體系;將離心管或八連排管置于PCR擴增儀中,按照耳聾易感基因檢測試劑盒(PCR+導流雜交法)標準操作規(guī)程進行PCR擴增反應,總反應時間約為2小時。(2)雜交:將上述PCR反應液變性后,按照標準操作規(guī)程進行導流雜交。(3)判讀:根據標準結果說明對上述導流雜交所產生的耳聾檢測膜條進行判讀。
對于所有納入本次研究的聽力正常對象,對其純音聽閾檢測及聲導抗檢查結果進行分析。對于納入的耳聾患者,對他們以下聽力檢查結果進行綜合分析,以確定聽力損失的性質及程度:①純音聽閾檢測(年齡>4歲,能良好配合的患者);②聲導抗檢查;③畸變產物耳聲發(fā)射(DOPAE)檢測;④聽性腦干檢測(ABR)及多頻聽性穩(wěn)態(tài)(ASSR)測試(年齡<4歲患者)。
在本次研究的72個家庭(105例)中,有18個家庭(36例)檢測到了耳聾熱點基因突變,檢出率為25%(18∕72)。在檢測出存在耳聾基因突變的家庭中,有9個家庭(13例)檢測到GJB2單基因突變,檢出率為12.5%(9∕72),包括6個家庭(9例)檢出GJB2單位點突變,檢出率為8.33%(6∕72),其中有3個家庭夫妻雙方為GJB2235d1C雜合突變,其子女均為GJB2235d1C純合突變并先后接受人工耳蝸植入術(Cochlear implantation,CI),另外3個家庭中父母雙方中只有一方被檢測出GJB2235d1C雜合突變,其子女均未檢出;有3個家庭(3例)檢測出GJB2復合雜合突變,檢出率為4.17%(3∕72),即父母被檢測出GJB2不同位點雜合突變,而子女在相同位點處均被檢出雜合突變。有5個家庭(9例)檢出SLC26A4單基因突變,檢出率6.94%(5∕72),其中3個家庭父母及孩子均檢測出SLC26A4919-2A>G雜合突變,另外2個家庭先證者檢測為SLC26A4919-2A>G純合突變,所有檢測出存在SLC26A4基因突變的孩子行顳骨高分辨CT均顯示雙側耳蝸發(fā)育畸形并雙側前庭導水管擴大,先后接受CI。有3個家庭(5例)檢測出線粒體12SrRNA單基因突變,檢出率4.17%(3∕72),其中所有先證者均為線粒體12SrRNA1555A>G均質突變,并通過詳細的家族史詢問得知,這些家庭中母親及其所生子女均存在不同程度的聽力損失。有1個家庭檢測出多基因復合突變,即母親檢測出c.235d1C及c.299_300delAT復合雜合突變,父親c.176del16、c.538C>T及c.IVS7-2A>G復合雜合突變,父親c.176del16、c.538C>T及c.919-2A>G雜合突變,其孩子檢測出c.538C>T及c.919-2A>G復合雜合突變。72個高危家庭的耳聾基因的突變位點、突變類型及突變檢出率詳見表1,18個檢出家庭的耳聾基因結果及聽力學檢查結果見表2。
表1 72個高危家庭的耳聾基因突變情況Table 1 Deafness gene mutations in 72 high-risk families
表2 1 8個檢出家庭的耳聾基因結果及聽力損失程度Table2 Deafnessgeneresultsandhearinglossin18detectedfamilies
本次研究中的105例高危家庭成員中,耳聾基因突變總攜帶率為34.3%(36∕105),其中聽力正常對象40例,基因突變檢出率為42.5%(17∕40),耳聾患者65例,基因突變檢出率為29.2%(19∕65)。經卡方檢驗,兩者耳聾基因突變檢出率之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
本次研究中的17例行CI的患者中,基因突變檢出率為41.2%(7∕17)。最常見的為GJB2基因突變,共4例;其次是SLC26A4基因突變,共2例;涉及GJB3、SLC26A4及線粒體12S rRNA多基因突變1例。在所有接受CI的患者中,除了1例GJB2-235d1C、299_300delAT復合雜合突變患兒為雙耳重度聽力損失,1例耳聾基因檢測為野生型的患兒表現為左耳極重度聽力損失、右耳重度聽力損失外,其余患者聽力學檢查均表示為極重度聽力損失。
來自F7家庭的父母前來咨詢再次生育下一代及已出生的孩子婚配后下一代出現HL的風險,夫妻雙方聽力正常但攜帶GJB2235d1C雜合突變,告知其c.235d1C遵循孟德爾隱性遺傳規(guī)律,其有25%的可能性再次生育聾兒,而已出生的孩子因c.235d1C上為純合突變,故其婚配對象建議行GJB2的基因檢測,從而達到有效預防生育HL后代。
來自F8家庭的父母前來咨詢女兒婚配后下一代出現HL的風險,因其女兒為GJB2上復合雜合突變,故其所生育后代極大可能攜帶有GJB2突變基因,建議婚配對象行GJB2全序列測序分析,以預防生育HL患兒。
來自F9家庭的父母前來咨詢女兒耳聾原因及其下一代發(fā)生耳聾的風險,其母親在孕早期曾有氨基糖苷類抗生素使用史,女兒為線粒體12S rRNA1555A>G上均質突變,推測可能與藥物致聾有關,該基因遵循母系遺傳規(guī)律,故其女兒下一代男女均對耳毒性藥物敏感,但只有女性可將突變的線粒體DNA傳遞給后代而男性則將不再將該突變下傳,因此其女兒下一代絕對禁用氨基糖苷類藥物,同時建議該家庭進一步行全序列測序,以排除其他耳聾基因的致病可能性。
HL作為最常見的出生缺陷之一,有相關流行病學調查[8-10]顯示,我國每年新增的6萬-8萬耳聾新生兒有60%以上與遺傳因素有關,特別是在NSHL方面,根據相關數據[11,12]顯示已確定的致病基因已超過80種,涉及的突變類型超過1000種,發(fā)現的相關致病基因區(qū)域超過150個。在我國人群中耳聾基因突變攜帶率為6.3%,使得遺傳性耳聾在我國有較高的發(fā)病基礎。在所有的致病基因中,約70%左右來自于GJB2、SLC26A4、線粒體12S rRNA及GJB3基因,比較各個基因的突變攜帶率,即GJB2約為3.16%,SLC26A4為2.75%,線粒體DNA為2.87%,可以看出我國最常見的致病基因突變?yōu)镚JB2[13],在我們本次研究中,GJB2基因突變最為常見,這與既往的耳聾基因流行病學調查結果具有一致性[14-16]。對于患有永久性HL的兒童來說,在語言獲取的關鍵時期未能得到特定的治療和康復,將在以后的語言、心理、認知和社交四個方面的表現存在一系列的問題。與此同時,培育一個HL患兒需要的醫(yī)療和非醫(yī)療費用十分高昂,這對相當一部分家庭,特別是有HL家族史的多聾病家庭來說,是一個沉重的壓力,因此盡早了解和預防新生兒HL對耳聾高危家庭來說是十分重要的。
本次研究中最常見的基因突變位點為GJB2上的c.235d1C,占所篩查的9個位點中的31.58%,與國內其他的流行病學調查相似[14,17]。GJB2基因編碼縫隙連接蛋白Cx26,該蛋白在膜上由6個亞基構成通道,通過在細胞間傳遞電解質及第二信使等物質,對信號轉導和物質交換起著重要作用,該蛋白異??蓪е聝榷毎麚p傷,影響毛細胞的前突觸結構,對耳蝸內的神經末梢不構成影響,故單純GJB2基因突變的患者CI預后及康復效果較好[18,19]。早年相關研究推測GJB2突變引起耳聾的原因可能由于縫隙連接功能障礙致耳蝸內淋巴液K+循環(huán)障礙。但近些年來研究發(fā)現GJB2缺陷耳聾主要是因為耳蝸發(fā)育障礙導致頂蓋膜無法移動,無法刺激毛細胞在聲刺激過程中產生聽覺受體電流,從而導致先天性耳聾。耳蝸外毛細胞電運動減少引起的電生理改變,導致耳蝸主動放大作用受損耳蝸主動放大障礙致遲發(fā)性耳聾[20]。關于GJB2突變導致耳聾的病理機制研究還在不斷發(fā)展。
本次研究中第二大常見突變基因為SLC26A4,主要編碼Pendfin蛋白,該蛋白的結構與功能復雜,主要在內耳的淋巴囊及淋巴管上表達,從而調節(jié)Cl-、HCO3-等在內耳淋巴內的離子平衡[21]。該基因突變可導致內耳淋巴囊或前庭水管擴大,導致的聽力下降可能為遲發(fā)性,在受到外界因素刺激后波動性下降最終發(fā)展成全聾,因此建議對該基因攜帶者,通常建議避免感冒、頭部撞擊等外界刺激及劇烈活動導致誘發(fā)HL[22],同時需要定期復查聽力情況。該基因與大前庭導水管綜合征(Large vestibular aqueduct syndrome,LVAS)密切相關,純合突變者行顳骨高分辨CT一般都能發(fā)現雙側耳蝸畸形及前庭導水管擴大,而單雜合突變攜帶者一般并不能發(fā)現前庭導水管擴大,發(fā)生HL的概率與正常人群一樣,故若HL患者耳聾基因篩查出現該位點單雜合突變,建議行全序列測序,避免遺漏其他位點突變。
本次研究發(fā)現了2例GJB3基因突變,其主要編碼的連接蛋白為Cx31,與上述兩個基因遺傳方式不同,其主要的遺傳方式可為常染色體顯性或隱性遺傳,根據相關文獻研究報道[22-24],其位點c.538C>T在不同性別中的表現具有異質性,在成年男性中可表現為漸近性或遲發(fā)性聽力下降,但在成年女性上可表現為聽力正?;虬Y狀不明顯,故我們建議F3家庭中的父親定期復查聽力情況。
線粒體12SrRNA基因被認為是導致藥物性耳聾的直接相關基因[25],且基因遺傳方式為母系遺傳,只要檢測出該基因存在突變,特別是當受檢者為孕婦時,其所生子女必定為該突變基因攜帶者,不論是均質突變還是異質突變,均表明被檢者對氨基糖苷類藥物的耳毒性敏感,出現“一針致聾”的風險極高[26,27],故應建議其本人及母系家族成員終身避免使用氨基糖苷類藥物。
必要的基因診斷及生育前遺傳咨詢可以為父母提供詳細的遺傳性信息[28],為有生育計劃的、結合家族史及后代患病的風險評估提供相關依據,最終做出客觀、準確的生育指導,特別是對于已經生育HL患兒的父母,如本次研究中的F1、F6、F10家庭來進行生育咨詢,三個家庭均為夫妻雙方聽力正常且其中一方基因檢測為單雜合突變,我們告知其下一代有50%概率為突變攜帶者,并建議其進行全外顯子測序進一步檢測,以避免遺漏耳聾相關其他位點是否存在突變。盡早進行產前診斷,讓父母提前對可能出現HL的新生兒做好充足的心理、醫(yī)學治療等方面的準備。
對于本次研究中的所有家庭我們都建議除了行耳聾基因篩查的同時行全外顯子測序,特別是出現基因突變表型與聽力損失程度不符的情況時,如單雜合突變伴HL患者或野生型伴HL患者,因可能存在其他致病突變,故建議其家庭成員完善全外顯子測序以明確造成聽力損失的病因。本次研究中來自F3家庭中的母親GJB2檢測結果為c.235d1C及c.299_300delAT復合雜合突變,根據常染色體隱性遺傳特點,母親在同一基因上存在雙位點突變,則母親可能存在聽力異常,但經聽力學檢查及基因復查,該母親聽力正常,結合先證者的基因檢測結果,推測母親雖然存在c.235d1C及c.299_300delAT雙位點突變,但這兩個突變位點可能位于同一染色體上,而另一條染色體正常,故母親不存在聽力損失。本次研究中對于有些高危家庭的耳聾基因篩查,因各種原因導致并沒有完整的包含兩代,即父母和子女,這是本次研究的不足之處。對于存在缺少家庭成員篩查情況的家庭,我們在電話通知其篩查結果的同時并建議相應家庭成員進行耳聾基因篩查,以便更好的分析耳聾突變位點的遺傳學研究。
目前,隨著對耳聾基因的研究不斷深入,不斷有新的基因及突變類型可能被納入耳聾基因篩查中,從而大幅度提高耳聾基因篩查的準確性,并為遺傳咨詢及遺傳病學研究提供更加可靠詳實的依據。
對于遺傳性HL,基因診斷及遺傳咨詢是目前主要的干預手段,目前主要還是在孕期階段進行產前診斷(二級預防)及新生兒階段進行耳聾基因篩查(三級預防),并不能有效減少HL發(fā)生,使對遺傳性HL的預防還停留在被動階段。而孕前就進行耳聾基因篩査(一級預防),從而得到相關的婚育指導,才能實現長效防聾、優(yōu)化人口質量。
在耳聾高危家庭成員中,耳聾基因突變攜帶率較高,因此對高危家庭人群盡早進行耳聾基因篩查,提供相應的耳聾基因診斷,幫助他們有效地阻斷遺傳性耳聾在家族中的傳遞,必要的產前診斷使高危家庭夫妻在孕期對可能出現HL的胎兒提早做好充足的準備,從而實現早篩查、早診斷、早治療。