孫傳菊 ，葛重宇，于長(zhǎng)杰，楊燕飛，沈玉萍?，楊 歡?

（1.無(wú)錫市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 無(wú)錫 214000；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.鎮(zhèn)江市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212050）

穿山龍收載于2015 年版《中國(guó)藥典》一部，為薯蕷科植物穿龍薯蕷Dioscorea nipponicaMakino的干燥根莖，于春、秋二季采挖，洗凈，除去須根和外皮，曬干，具有祛風(fēng)除濕、舒筋通絡(luò)、活血止痛、止咳平喘等功效［1］。江慧等［2］優(yōu)化了穿山龍中薯蕷皂苷的酶提取工藝，然而穿龍薯蕷中甾體皂苷的種類較多［3］，以這些皂苷類為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制時(shí)需要多個(gè)對(duì)照品，且分析條件復(fù)雜，不利于開(kāi)展日常檢測(cè)工作。薯蕷皂苷元是穿山龍總甾體皂苷的體內(nèi)代謝產(chǎn)物，近年來(lái)對(duì)該化合物的生物活性研究較為廣泛，具有抗腫瘤［4］、提高認(rèn)知功能［5］、緩解神經(jīng)病理性疼痛［6］、保護(hù)甲亢性肝損害［7］等藥理作用，能夠通過(guò)抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶等而產(chǎn)生降血糖效果［8-9］，抑制甲狀腺細(xì)胞增殖并緩解甲狀腺腫大［10］，是該中藥的質(zhì)量控制指標(biāo)之一，亦是制藥工業(yè)中合成甾體類藥物的重要中間體［11］。

在對(duì)穿山龍進(jìn)行質(zhì)量控制時(shí)，通常對(duì)藥材進(jìn)行直接酸水解［12］，或以索氏抽提法獲得總皂苷后進(jìn)行常壓酸水解，并以石油醚從水解液中萃取薯蕷皂苷元，從而制備得到供試品溶液，然后采用HPLCUV 定量分析［13-15］。但穿山龍中含有大量的淀粉和纖維素，因而在水解過(guò)程中不得不使用高濃度酸［16］，導(dǎo)致薯蕷皂苷元發(fā)生脫水、異構(gòu)化等副反應(yīng)；索氏抽提法消耗時(shí)間長(zhǎng)，效率較低；常壓條件下反應(yīng)體系達(dá)不到較高的溫度，導(dǎo)致薯蕷總皂苷的水解不徹底，所測(cè)定的含有量偏低。

本研究建立了一種基于加壓技術(shù)制備穿山龍供試品溶液的新方法，采用加壓液體萃取法從穿山龍中獲取總皂苷，加壓兩相酸水解技術(shù)萃取薯蕷皂苷元，具有耗時(shí)短、酸濃度低、得率高等優(yōu)點(diǎn)。然后，建立了HPLC-UV 法測(cè)定薯蕷皂苷元的分析條件，進(jìn)行方法學(xué)考察，并比較了10 個(gè)不同產(chǎn)地31批藥材中薯蕷皂苷元的含有量。

1 材料

AE240 電子分析天平（萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；Alpha 1-2LD 冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ 公司）；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；GSH-0.5 加壓反應(yīng)釜（內(nèi)膽PTFE 覆膜，威海坤昌化工有限公司）；RHP-800 型高速多功能粉碎機(jī)（浙江永康榮浩工貿(mào)有限公司）；20AVp HPLC 系統(tǒng)（日本島津公司）；N2000 SP1 色譜工作站（浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司）。薯蕷皂苷元對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)111539-200001）。超純水（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；乙腈為色譜純（美國(guó)歐姆尼公司）；其他試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

穿山龍于2017 年11 月至2018 年4 月采自黑龍江伊春、黑龍江尚志、吉林樺甸、吉林通化、吉林白山、遼寧葫蘆島、陜西寶雞、河南洛陽(yáng)、山東泰安和江蘇鎮(zhèn)江，并經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)研究所陳鈞教授鑒定為穿龍薯蕷Dioscorea nipponicaMakino 的根莖。藥材經(jīng)冷凍干燥、粉碎后過(guò)40 目篩，收集細(xì)粉，置于電子干燥箱中保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 沃特世Sunfire RP18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-水（88∶12）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；進(jìn)樣量20 μL；分析時(shí)間15 min。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取薯蕷皂苷元14.00 mg，無(wú)水乙醇溶解并定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為1 400 μg／mL 的對(duì)照品貯備液，無(wú)水乙醇2 倍稀釋，依次得到質(zhì)量濃度為700.0、350.0、175.0、97.50、43.75、21.88、10.94 μg／mL 的對(duì)照品溶液，并用0.22 μm 針頭式微孔濾器過(guò)濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，即得。

2.3 供試品溶液制備

2.3.1 加壓液體萃取-加壓雙相酸水解法 精密稱取穿山龍粉末8.00 g，按1∶4 比例與細(xì)沙混合并裝填于不銹鋼色譜柱中，加入50%乙醇160 mL 于80 ℃下加壓萃取4 h，收集流出液，減壓回收至無(wú)醇味，200 μL 濃硫酸定容至50 mL，再加入50 mL石油醚（90～120 ℃），于150 ℃下加壓水解2.0 h，持續(xù)攪拌（100 r／min）。分取石油醚層，水洗至中性，減壓回收溶劑至干，殘留物以無(wú)水乙醇溶解并定容至100 mL，用0.22 μm 針頭式微孔濾器濾過(guò)，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，即得。

2.3.2 索氏抽提-常壓酸水解法 精密稱取穿山龍粉末8.00 g，加入甲醇索氏抽提24 h，減壓回收溶劑至干，加入2.0 mol／L 硫酸100 mL，沸水浴中回流水解4 h，傾出，冷卻后用石油醚液液萃取，減壓回收溶劑，殘留物以無(wú)水乙醇溶解并定容至100 mL，0.22 μm 針頭式微孔濾器過(guò)濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 吸取10.94、21.88、43.7、97.50、175.0、350.0、700.0、1 400 μg／mL 對(duì)照品溶液，以薯蕷皂苷元峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程Y=9 715 299.5X-88 785.6（r=0.999 5），表明薯蕷皂苷元在10.94～1 400 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 薯蕷皂苷元HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of diosgenin

2.5 精密度試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液（1 400、175.0、10.94 μg／mL）及供試品溶液（吉林白山），在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得薯蕷皂苷元色譜峰峰面積RSD 分別為0.87%、0.68%、1.62%、0.92%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取吉林白山產(chǎn)藥材制備供試品溶液，于室溫下避光密閉保存，于4、8、12、24、48、72 h 在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得峰面積RSD 為1.68%，表明溶液在72 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取吉林白山產(chǎn)藥材制備供試品溶液6 份，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得薯蕷皂苷元含有量RSD 為1.85%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取吉林白山產(chǎn)藥材粉末9 份，每份4.00 g，精密稱定，以加壓液體萃取法獲取總皂苷，并加入一定量對(duì)照品，加壓雙相酸水解法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 薯蕷皂苷元加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.1 Results of recovery tests for various diosgenin（n=3）

2.9 樣品含有量測(cè)定 表2 表明，采用加壓液體萃取-加壓雙相酸水解法制備供試品溶液，測(cè)得吉林白山產(chǎn)穿山龍中薯蕷皂苷元的平均含有量為1.612%，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的索氏抽提-常壓酸水解法；而且，新方法的耗酸量及提取、水解時(shí)間均大幅降低，有利于環(huán)境保護(hù)，提高制備效率。公式如下。

增加率=｛［（加壓液體萃取-加壓雙相酸水解法）-（索氏抽提-常壓酸水解法）］／（索氏抽提-常壓酸水解法）｝ ×100%。

減少率=｛［（索氏抽提-常壓酸水解法）-加壓液體萃取-加壓雙相酸水解法）］／（索氏抽提-常壓酸水解法）｝ ×100%。

表2 新供試品制備方法與傳統(tǒng)方法的比較（n=3）Tab.2 Comparison of novel method with conventional method（n=3）

然后，以加壓液體萃取-加壓雙相酸水解法分別制備31 批10 個(gè)產(chǎn)地供試品溶液各3 份，測(cè)定薯蕷皂苷元色譜峰峰面積，代入回歸方程，計(jì)算含有量，見(jiàn)圖2。由圖可知，供試品溶液中的薯蕷皂苷元可以與各干擾組分達(dá)到基線分離（R＞1.5）。

圖2 不同產(chǎn)地樣品HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of samples from different growing areas

表3 表明，穿山龍中薯蕷皂苷元的平均含有量0.695%～2.263%，其中產(chǎn)于黑龍江伊春的最高，而且東北三省遠(yuǎn)高于其他產(chǎn)地。One-way ANOVA統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)圖3，可知東北三省所采集的藥材中以遼寧葫蘆島產(chǎn)含有量最低，但也顯著高于陜西寶雞產(chǎn)（P＜0.05），并且極其顯著高于河南洛陽(yáng)、山東泰安、江蘇鎮(zhèn)江產(chǎn)（P＜0.01）。

3 討論與結(jié)論

在對(duì)穿山龍藥材的供試品溶液中的薯蕷皂苷元進(jìn)行分析時(shí)，比較了色譜柱SunFire RP18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Luna C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Eclipse XDB C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm），發(fā)現(xiàn)采用SunFire RP18色譜柱時(shí)，薯蕷皂苷元大約在10 min 出峰，時(shí)間適中，色譜峰的對(duì)稱性好，并且與其他成分實(shí)現(xiàn)了基線分離。

在以傳統(tǒng)技術(shù)制備穿山龍供試品溶液的過(guò)程中，常用索氏抽提法、直接酸水解法，存在耗時(shí)長(zhǎng)、硫酸濃度高、測(cè)定含有量偏低等不足。本研究采用了加壓液體萃取法和加壓兩相酸水解法，在加壓條件下，前者可以使穿山龍中的總甾體皂苷被快速、徹底地萃取出來(lái)；后者則只需要使用低濃度硫酸，并且水解時(shí)間大為縮短，有利于保護(hù)薯蕷皂苷元的化學(xué)結(jié)構(gòu)［17］，從而使含有量得以提高，并有利于環(huán)境保護(hù)，提高制備效率。

表3 不同產(chǎn)地樣品中薯蕷皂苷元的含有量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.3 Results of content determination of diosgenin in samples from different growing areas（n=3）

圖3 不同產(chǎn)地樣品中薯蕷皂苷元含有量的比較Fig.3 Comparison of contents of diosgenin in samples from different growing areas

穿山龍主要分布于東北、華北、山東、河南、安徽、浙江北部、江西（廬山）、陜西（秦嶺以北）、甘肅、寧夏、青海南部、四川西北部，其中黑龍江、吉林、遼寧一直被認(rèn)為是該藥材的道地產(chǎn)區(qū)［18］。本研究測(cè)定了從以上產(chǎn)地采收的31 批穿山龍中薯蕷皂苷元含有量，發(fā)現(xiàn)東北地區(qū)顯著高于其他地區(qū)，可見(jiàn)薯蕷皂苷元作為該藥材的指標(biāo)性成分，能夠較好地體現(xiàn)其道地性。