袁志鷹，夏江南，劉月新，江星明?，陳乃宏，2，4，許光明，周小江，2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化與功能工程技術(shù)中心，湖南 長沙 410208；3.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)中心，湖南 長沙 410208；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050）

百合為百合科百合屬多年生草本球根植物，株高一般約70～150 cm，鱗莖為其主要藥用部位，由多片肉質(zhì)肥厚、卵匙形的鱗片聚合而成，具有養(yǎng)心安神、潤肺止咳功效［1-3］。湖南龍山卷丹百合Lilium lancifoliumThunb.種植基地是我國最大的藥用百合種植集中區(qū)，是龍山縣的支柱產(chǎn)業(yè)［4-5］。卷丹百合含有酚酸、酚酸甘油酯、皂苷等多種活性成分，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多種藥理活性［6-8］，而課題組前期研究發(fā)現(xiàn)王百合苷A 在多批次百合藥材均存在，因此深入研究王百合苷A 非常有意義。

土壤是中藥材種植栽培的基礎(chǔ)，更是其生長發(fā)育所需水、熱、氣、肥的供應(yīng)者。從植物營養(yǎng)學(xué)和環(huán)境脅迫的角度來說，土壤肥力勢必影響到中藥材的有效成分含有量［9-10］，從而影響到中藥方劑臨床治療效果。而土壤肥力因子種類較多，借助內(nèi)梅羅綜合指數(shù)法將土壤中各肥力因子的影響整合為一個(gè)指數(shù)［11-13］，可探究土壤肥力與百合藥材主要活性成分的相關(guān)性。

本研究通過測試龍山縣百合種植代表性基地土壤的各項(xiàng)肥力指標(biāo)，參照國家土壤屬性分級標(biāo)準(zhǔn)，運(yùn)用改進(jìn)的內(nèi)梅羅綜合指數(shù)法對土壤肥力進(jìn)行綜合評價(jià)，并利用UPLC方法測定對應(yīng)土壤種植的卷丹百合藥材中王百合苷A 的含有量，探究土壤肥力因子對百合主要化學(xué)成分王百合苷A含有量的影響，以期為卷丹百合生產(chǎn)基地的選址及其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Agilent 1290 Infinity 型超高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；KM-250DE 中文液晶臺(tái)式超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）；AA-7000 原子吸收分光光度計(jì)（日本島津公司）；TU-1900 紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；電爐（北京市永光明醫(yī)療儀器廠，功率1 000 W）；FW100 高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；AR124CN 電子天平（上海奧豪斯有限公司）；SMART 2 PURE 智能一體化超純水系統(tǒng)（美國賽默飛世爾科技公司）。王百合苷A 對照品（0252-DT01，上海詩丹德公司）。氯化鉀（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈為色譜純（韓國LG 公司）；HCl、H2SO4、NaOH、K2Cr2O7等試劑均為分析純。

1.2 樣品采集 龍山百合種植基地位于湘西，海拔400～1 100 m，年均氣溫15.8 ℃，極端最高氣溫39.5 ℃，極端最低氣溫-6.9 ℃，年平均降雨量1 308.1 mm，年均日照時(shí)數(shù)1 153.6 h，全年無霜期285 d。2017 年7 月，在野外詳細(xì)調(diào)查的基礎(chǔ)上，選取5 塊典型田地為研究對象（2 塊必須輪作才能種植百合，3 塊連續(xù)3 年連作都能種植百合）。土壤樣品按照“S”型5 點(diǎn)采樣法，采集0～30 cm 土壤，混合均勻，去除植物根系和石塊等，自然風(fēng)干磨細(xì)后，分別過孔徑1 mm 和0.25 mm 篩，裝入保鮮袋備用。

卷丹百合地下鱗莖分別采自對應(yīng)的研究田地，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥系周小江教授鑒定為百合科百合屬植物卷丹Lilium lancifoliumThunb.的新鮮鱗莖，洗凈后干燥粉碎，過100 目篩備用。具體見表1。

表1 樣品信息

1.3 土壤測定方法 本研究選擇土壤主要的7 個(gè)肥力指標(biāo)（土壤有機(jī)質(zhì)、全N、全P、全K、有效P、水解性N、速效K）作為研究內(nèi)容，土壤有機(jī)質(zhì)采用外加熱-重鉻酸鉀容量法（NY／T 1121.6-2006），土壤全N 采用半微量開氏法（NY／T53-1987），土壤全P 采用標(biāo)準(zhǔn)（森林土壤磷的測定LY／1232-2016），土壤全K 采用標(biāo)準(zhǔn)（森林土壤鉀的測定LY／T 1234-2014），土壤有效P 采用標(biāo)準(zhǔn)（NY／T 1121.7-2014），土壤水解性N 采用標(biāo)準(zhǔn)（LY／T 1228-2015），土壤速效K 采用標(biāo)準(zhǔn)（LY／T 1234-2015）進(jìn)行測定。

1.4 UPLC 測定方法

1.4.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.5% 磷酸（B），梯度洗脫（0～15.2 min，1%～10% A；15.2～15.5 min，10%～15% A；15.5～17.5 min，15%～25% A；17.5～19.5 min，25%～30% A；19.5～22 min，30%～40% A；22～25 min，40%～75% A；25～27 min，75%～90%A；27～29 min，90%～95%A；29～31 min，95%～1%A）；體積流量0.20 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長308 nm；進(jìn)樣量2.0 μL。

1.4.2 供試品溶液制備 精密稱取0.5 g 過100 目篩的藥材粉末，加入30 mL 80%乙醇，靜置1 h，超聲40 min 后過濾，即得。

1.4.3 對照品溶液制備 精密稱取王百合苷A 對照品置于量瓶中，加80% 乙醇溶解稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.560 mg／mL的溶液，即得。

1.4.4 線性關(guān)系考察 精密量取王百合苷A 對照品置于量瓶中，加入80% 乙醇溶解，搖勻，稀釋配成質(zhì)量濃度為0.5、10、50、100、350、600 μg／mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在“1.4.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸。得王百合苷A 回歸方程為Y=0.048 4X+2.568 6（r=0.999 5），在0.5～600 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.4.5 方法學(xué)考察 對方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率考察，結(jié)果表明各指標(biāo)均符合含有量測定要求，加樣回收圖見圖1。

圖1 王百合苷A UPLC 色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤肥力測定 土壤樣品主要肥力指標(biāo)測定結(jié)果見表2。在5 個(gè)樣品中，含有量分別為有機(jī)質(zhì)14.3～25.6 g／kg、全氮0.93～1.69 g／kg、全磷0.18～1.14 g／kg、全鉀10.6～26.9 g／kg、有 效 磷7.4～93.8 mg／kg、水 解 性 氮60.3～159.0 mg／kg、速效鉀52.0～259.0 mg／kg。對土壤中有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、有效磷、水解性氮、速效鉀變異系數(shù)（CV）［14］的分析發(fā)現(xiàn)，龍山百合種植土壤中有效磷的變異系數(shù)屬于強(qiáng)變異（CV≥90%），由此可知，龍山縣百合栽培土壤中有效磷的含有量差異巨大；全氮、全磷、全鉀、水解性氮、速效鉀均屬于中等強(qiáng)度變異（20% ＜CV＜90%），這幾種成分的含有量在土壤中具有一定的穩(wěn)定性。有機(jī)質(zhì)含有量變異系數(shù)為20%最小，含有量最為穩(wěn)定。

表2 土壤主要肥力指標(biāo)及變異系數(shù)

2.2 肥力因子等級劃分 根據(jù)《全國第二次土壤普查標(biāo)準(zhǔn)》，對龍山百合種植基地土壤養(yǎng)分肥力進(jìn)行分級，得到樣品土壤中各養(yǎng)分指標(biāo)的等級，見表3。

表3 土壤樣品養(yǎng)分等級

由表3 可知，基地土壤中有效磷及速效鉀的含有量極高，達(dá)到農(nóng)作物耕地土壤的一二級標(biāo)準(zhǔn)，處于上等水平；有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮、水解性氮和全鉀的含有量適中，位于第三等級，處于中等水平。

2.3 綜合評價(jià) 土壤肥力采用改進(jìn)的內(nèi)梅羅綜合指數(shù)法進(jìn)行綜合評價(jià)。主要因子包括有機(jī)質(zhì)、全氮、水解性氮、全磷、有效磷、全鉀和速效鉀。對上述參數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算，以消除各參數(shù)間差別，處理方法［11］見表4。

表4 土壤肥力等級劃分

其中，Pi稱為分肥力系數(shù)，Ci為該屬性測定值。土壤各屬性因子的分級標(biāo)準(zhǔn)（Xa、Xc、Xp）主要參照《全國第二次土壤普查標(biāo)準(zhǔn)》劃分，見表5。

表5 第二次全國土壤普查劃分

采用改進(jìn)的內(nèi)梅羅綜合指數(shù)法作為評價(jià)模型對龍山百合種植基地土壤肥力質(zhì)量進(jìn)行綜合評價(jià)，計(jì)算式［11］為

式中，P為土壤綜合肥力系數(shù)，Pi平均值為土壤各屬性分肥力系數(shù)的平均值，Pi最小為各分肥力系數(shù)中最小值。n為參與評價(jià)的土壤屬性個(gè)數(shù)。最后根據(jù)修正的內(nèi)梅羅公式計(jì)算的綜合肥力系數(shù)（P）給出土壤的肥力評價(jià)，評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下，P≥2.7，很肥沃；P1.8～2.7，肥沃；P0.9～1.8，一般；P＜0.9，貧瘠。見表6。

結(jié)果表明，土壤1 與土壤2 綜合肥力系數(shù)最低，處于貧瘠水平，與當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)采取輪作的方式相符，而土壤3～5的綜合肥力系數(shù)相對較高，屬于一般肥力水平，亦與藥農(nóng)采取連作的栽培方式相符。但總體來看，5 個(gè)土壤樣品的綜合肥力系數(shù)均低于1.8，值得關(guān)注。

表6 土壤綜合評價(jià)結(jié)果

2.4 土壤肥力因子與王百合苷A 的相關(guān)性 分別精密稱取5 份不同采樣點(diǎn)的龍山卷丹百合，按“1.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.4.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測定王百合苷A 含有量，每份樣品平行2 次，重復(fù)測定2 次，結(jié)果見表7，通過SPSS、EXCEL 軟件分析肥力因子與百合主要活性成分王百合苷A 的相關(guān)性，擬合方程結(jié)果和響應(yīng)關(guān)系圖，見表7、圖2。結(jié)果顯示，王百合苷A 和土壤綜合肥力系數(shù)呈負(fù)相關(guān)響應(yīng)，可用環(huán)境脅迫理論［15］來進(jìn)行解釋。黃璐琦等［16］提出，逆境可能更利于中藥道地性的形成，較差的土壤條件迫使百合中部分次生代謝產(chǎn)物含有量增加以增加對惡劣環(huán)境的耐受。

表7 王百合苷A 含有量及土壤肥力相關(guān)性

圖2 王百合苷A 含有量與土壤綜合肥力系數(shù)響應(yīng)圖

3 討論

通過對各肥力指標(biāo)的變異系數(shù)和等級劃分可知，龍山百合種植土壤中有效磷的平均水平達(dá)到一級肥力標(biāo)準(zhǔn)而其變異系數(shù)為90%，屬于強(qiáng)變異，表明該地有效磷含有量豐富但分布不均勻，可能與該地的地表形態(tài)與人工施肥不均有關(guān)。全氮、全磷、全鉀、水解性氮、速效鉀均屬于中等強(qiáng)度變異，有機(jī)質(zhì)含有量變異系數(shù)為20%，屬于低強(qiáng)度變異，表明當(dāng)?shù)胤N植土壤有機(jī)質(zhì)分布較為均勻，其中速效鉀的含有量達(dá)到二級肥力標(biāo)準(zhǔn)，含有量極高；全磷、全鉀、全氮、水解性氮、有機(jī)質(zhì)含有量處于三級肥力標(biāo)準(zhǔn)，處于中等水平。

本研究對湖南龍山縣卷丹百合種植基地土壤的主要肥力指標(biāo)綜合性評價(jià)研究，結(jié)果顯示，龍山縣卷丹百合種植基地土壤肥力處于一般水平；從單個(gè)土壤樣品的綜合肥力系數(shù)來看，土壤1 與土壤2 綜合肥力系數(shù)最低，處于貧瘠水平，與當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)采取輪作的方式相符，而土壤3～5 的綜合肥力系數(shù)相對較高，屬于一般肥力水平，亦與藥農(nóng)采取連作的栽培方式相符。因此，中藥材種植與其土壤綜合肥力系數(shù)具有高度關(guān)聯(lián)性，需引起進(jìn)一步關(guān)注。

改良的內(nèi)梅羅綜合指法計(jì)算土壤肥力綜合系數(shù)P，并與百合主要成分王百合苷A 的含有量進(jìn)行SPSS／EXCEL 相關(guān)性響應(yīng)分析。本實(shí)驗(yàn)中選定的5 塊代表性土壤樣品的肥力因子與王百合苷A 呈負(fù)相關(guān)響應(yīng)，可能較差的土壤條件迫使百合中主要的次生代謝產(chǎn)物—王百合苷A 含有量增加，以增加對惡劣環(huán)境的耐受。