黃靜, 郭洋, 項濤, 吳大鵬, 陳丹, 楊正偉, 李陽友

(川北醫(yī)學院1. 實驗動物中心; 2. 形態(tài)定量研究室; 3. 動物發(fā)育研究室; 南充 637000)

脾臟具有造血、濾血、儲血及免疫等重要功能。結(jié)構(gòu)是功能的基礎, 脾臟自身的結(jié)構(gòu), 隨著年齡階段的不同, 存在很大差異, 早期的大鼠脾臟結(jié)構(gòu)不完整, 至3月齡時各種結(jié)構(gòu)才具有典型組織學形態(tài)[1]。但是很少有大齡大鼠脾臟的組織結(jié)構(gòu)特點報道。本文擬研究正常大鼠脾臟3年內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)顯微特點變化情況, 觀察脾內(nèi)各種結(jié)構(gòu)的顯微變化, 為未來相關(guān)研究提供方法和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與脾臟取樣

SPF級新生雄性SD大鼠228只購自川北醫(yī)學院實驗動物中心[SCXK(川)2013-18]。分別在不同發(fā)育生長階段(1日齡、1月齡、3月齡、6月齡、12月齡、24月齡和36月齡)隨機取7只, 稱量大鼠體質(zhì)量, 腹腔注射3%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉,取下完整脾臟, 用電子天平(日本A＆D Company，HR-120 型，精度0.1 mg)稱量脾臟的重量，并用已知密度的不同濃度蔗糖或乙醇溶液測量脾臟的密度，該動物脾臟的總體積可由所得脾臟的重量除以密度得到[2,3]。脾臟放入配置好的Bouin液內(nèi)浸潤固定2 d后，放入體積分數(shù)70%乙醇溶液固定保存(4℃冰箱)備用。

1.2 切片制備

脾臟組織塊經(jīng)Bouin液固定, 乙醇和正丁醇脫水后，包埋于甲基丙烯酸樹脂中，從包埋塊中切取出1張20 μm厚的切片(半自動切片機-德國Leica Biosystems GmbH的RM2235型和鎢鋼刀)，最后用過碘酸-席夫試劑(PAS)和蘇木精進行染色。采用日本Olympus的BX53型生物顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計檢驗

計量資料以表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用單因素重復檢測的方差分析，并結(jié)合Student-Newman-Keuls法進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量與脾臟的重量

本實驗中大鼠1日齡到36月齡，整個飼養(yǎng)過程未出現(xiàn)異常情況，24月齡前出現(xiàn)零星死亡，原因不明；24至36月齡，年老大鼠出現(xiàn)不愿意走動，反應遲鈍，個別年老鼠出現(xiàn)腹腔腫瘤，腹水，最后死亡。

隨著年齡的增加，SD大鼠體質(zhì)量不斷增加，3月齡內(nèi)增長迅速，是初生重的39倍，直到24月齡以后，才開始減輕。脾臟的重量在出生后2個月內(nèi)不斷增加，并基本發(fā)育完全，3月齡至12月齡基本穩(wěn)定(表1)。

表 1 不同月齡SD大鼠體質(zhì)量以及脾臟重量

2.2 脾臟組織學觀察

1日齡大鼠脾臟組織可見動脈周圍淋巴鞘和脾索結(jié)構(gòu)，但主要由密集的細胞組成，細胞種類難以辨認，其中存在少量巨核細胞，沒有明顯的血管結(jié)構(gòu)(圖1A)。1月齡大鼠脾臟的結(jié)構(gòu)較1日齡變化大，紅髓結(jié)構(gòu)發(fā)育完整，脾索清楚，大部分切片的脾血竇里已開始出現(xiàn)紅細胞，被膜薄，脾小梁發(fā)達(圖1B)。2月齡時，白髓出現(xiàn)脾小結(jié)，脾臟結(jié)構(gòu)發(fā)育完成，紅髓區(qū)域大于白髓區(qū)域，血竇出現(xiàn)大量紅細胞，被膜增厚，有明顯的血管結(jié)構(gòu)(圖1C)。3月齡時，紅白髓結(jié)構(gòu)明顯，分界清楚，白髓區(qū)域增大，小結(jié)廣泛存在，被膜較2月齡變薄(圖1D); 6月齡至1年齡大鼠，脾臟組織紅白髓結(jié)構(gòu)分明，各自所在區(qū)域大致相同(圖1E和圖1F); 24月齡至36月齡，大鼠處于老齡階段，脾臟組織紅白髓界限模糊，結(jié)構(gòu)不清楚(圖1G和圖1H)。

3 討論

本文研究表明，SD大鼠從出生至24月齡，體質(zhì)量呈現(xiàn)線性正相關(guān)增長，而從24月齡以后，體質(zhì)量有所減輕，符合動物生長規(guī)律。

1日齡SD大鼠脾臟, 有了動脈周圍淋巴鞘結(jié)構(gòu)[4], 該結(jié)構(gòu)在大鼠妊娠19 d開始形成，20 d由高度發(fā)達的網(wǎng)狀細胞，相互交結(jié)而形成三維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，為形成初期的脾索奠定了基礎[5]。1月齡大鼠脾臟，紅髓中的血竇富含大量血細胞，此時的造血功能旺盛，于3月齡后，造血功能才逐漸消失[6]; 此時，邊緣區(qū)結(jié)構(gòu)明顯，是白髓向紅髓移走的區(qū)域，是最先接接受抗原刺激的地方，充分發(fā)揮T、B淋巴細胞和巨噬細胞的功能，免疫功能發(fā)揮作用。

2月齡大鼠脾臟已形成所有結(jié)構(gòu)，但是各結(jié)構(gòu)界限不容易辨別。本實驗方法采用甲基丙烯酸樹脂包埋切片，由于切片厚度較厚，可能對結(jié)構(gòu)觀察有所影響[2]。血竇充滿大量血液，白髓中形成小結(jié)，小結(jié)的B細胞增殖產(chǎn)生大量的效應B細胞，從而分化為漿細胞，產(chǎn)生抗體，免疫功能增強。并且被膜顯著增厚，被膜延伸形成的小梁，通過收縮，將大量的血細胞釋放到需要的特定位置[1]，這體現(xiàn)了脾臟儲藏血液和作為血液通路上的作用。此時，脾臟的組織結(jié)構(gòu)完全形成，功能完全建立[9-10]。

脾臟結(jié)構(gòu)，不僅存在種間差異，而且同種動物在不同發(fā)育狀態(tài)和不同生理狀態(tài)，其結(jié)構(gòu)也存在差異[4]。SD大鼠生長至3月齡，白髓區(qū)域增大，生發(fā)中心明顯，免疫功能大大增強; 6月齡至12月齡，紅、白髓結(jié)構(gòu)區(qū)域大致相同，此時在儲藏血液和免疫功能上發(fā)揮重要作用; 24月齡至36月齡, 紅髓和白髓結(jié)構(gòu)變得模糊。大于22月齡大鼠脾內(nèi)的生發(fā)中心數(shù)及其內(nèi)的細胞數(shù)減少60%～95%[5]，24月齡以后，免疫功能急劇下降。本實驗表明，脾臟的動脈周圍淋巴鞘、脾小結(jié)、生發(fā)中心、邊緣區(qū)及血竇等結(jié)構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展和消退的變化，反應在不同日齡階段、脾臟功能結(jié)構(gòu)的變化。

圖 1 大鼠脾臟組織學觀察