張 興，陳 麒，張一樂，宋秀明，劉魯炯，徐貴華，張藝寶，張 煒

（上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海201203）

肺間質纖維化屬于炎癥性疾病，病變常累及肺泡上皮細胞、肺間質等[1]，是一種進行性、致死性的肺纖維化疾病[2]，其發(fā)病機制尚未明確[3]，有效的治療手段亦未被明確[4-5]。肺間質纖維化已成為呼吸系統(tǒng)領域研究公認的難點和熱點。中醫(yī)藥治療肺間質纖維化的研究近年來廣受關注[6-10]，為肺間質纖維化的治療提供了參考。

現(xiàn)代研究表明，生地的主要成分是梓醇等苷類成份、糖類和多種氨基酸等，生地的藥理作用包括調節(jié)免疫功能、抗氧化損傷等[11]。我們前期研究[12-13]發(fā)現(xiàn)生地注射液可減輕肺纖維化模型動物肺泡炎及肺纖維化程度，并能改善膠原代謝和對氧自由基的清除能力；還證實生地對肺纖維化干預可能是通過轉化生長因子-β1（TGF-β1）表達，從而減輕Ⅲ型膠原（Col Ⅲ）的異常沉積這一途徑而發(fā)揮作用。前期臨床研究[14]還發(fā)現(xiàn)生地注射液能改善肺纖維化患者的主要癥狀，提高血氧分壓、血氧飽和度和6 min 步行距離。

本研究采用博萊霉素氣管內注入法制作大鼠肺纖維化模型，重點探究生地提取物對肺纖維化大鼠血氣分析、肺組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及干擾素-γ（IFN-γ）指標的影響情況，以研究生地對肺纖維化的治療作用及其可能的機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級雄性SD 大鼠216 只，體質量（200±5）g，購自上海西普爾－必凱實驗動物有限公司（合格證編號2016000577159），飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院動物實驗中心。

1.2 藥物及試劑 生地提取物（10 mL/支，2 g 生藥/mL，生地水煎醇提物，上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院中藥制劑室，批號160910）；甲強龍粉劑（注射用甲潑尼松龍琥珀酸鈉，40 mg/支，法瑪西亞·普強公司卡拉瑪祖分廠，批號160JTB）；注射用鹽酸博萊霉素（Bleomycin）（15 mg/支，日本化藥株式會社，批號J162310）；鹽酸氯胺酮注射液（50 mg/mL，上海中西藥業(yè)股份有限公司新岡制藥廠，批號160408）；地西泮注射液（5 mg/mL，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號160501）；肝素鈉注射液（6250 單位/mL，中國江蘇常州生化千紅制藥有限公司，批號160512）；TNF-α 檢測試劑盒（晶美生物工程有限公司）；IFN-γ 檢測試劑盒（晶美生物工程有限公司）。

1.3 實驗儀器 輪轉切片機（Leizi Jung RM 2035 Germany）；顯微鏡（Olympus BX-6 Japan）；血液氣體分析儀（Roche OMNI modular system）；生化分析儀（Abbott Aeroset）；免疫酶標儀（Labsystems Dragon Wellscan MK3）；722 分光光度計（上海第三分析儀器廠）。

2 方法

2.1 模型制備 大鼠購回后于室溫20 ℃，自然光照條件下適應性飼養(yǎng)1 周。采用博萊霉素氣管內注入法復制大鼠肺纖維化模型。予地西泮（20 mg/kg）腹腔注射，再予鹽酸氯氨酮（20 mg/kg）腹腔注射麻醉。待麻醉后將大鼠仰臥固定，消毒并切開頸部皮膚，逐層鈍性分離軟組織，暴露氣管。在肉眼直視下，將已抽取博萊霉素溶液（8 mg ∶2 mL）的1 mL 注射器經兩氣管軟骨間隙向心刺入氣管并繼續(xù)進針約0.75 cm，回抽無阻力后迅速注入0.3 mL 藥液，隨即將大鼠直立旋轉，使藥液在肺內均勻分布。縫合切口，局部皮膚作抗感染處理。正常組動物不造模，假手術組動物造模方法同造模組，僅用生理鹽水替換博萊霉素進行氣管內注入。

2.2 大鼠分組 隨機分出正常組（27 只）、假手術組（27 只）和博萊霉素造模組（108 只）3 組，108 只大鼠造模成功后，按隨機數字表隨機分入4 個治療組：模型組、生地注射組、生地口服組和甲強龍組，每組27 只。

2.3 藥物干預 據“人和動物按體表面積折算的等效劑量比值表”折算[15]，以臨床劑量換算大鼠用藥劑量。生地注射組每日按10 mL/kg 體重腹腔注射生地提取物；生地口服組每日按1.5 mL/kg 體重腹腔注射生地提取物；甲強龍組每日按2 mg/kg 體重腹腔注射甲強龍，正常組和模型組每日予注射用水按10 mL/kg 體重灌胃。上述各組均造模后第1 天開始干預，直至處死日。

2.4 大鼠處理 各組分別于造模后第3 天、第7 天及第28 天各處死1/3 大鼠，即9 只大鼠。大鼠稱重后予鹽酸氯胺酮（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，大鼠仰臥固定，打開腹腔，予1 mL 肝素化針筒經腹主動脈穿刺采動脈血0.6 mL，即刻封閉針孔送血氣分析檢測。采血后立即延長切口打開胸腔，于近甲狀軟骨處切斷氣管，完整取出心肺。先將心臟和胸腺摘除干凈取出完整肺臟組織，用0.9%生理鹽水將取出的肺臟沖洗干凈，放入無菌樣品管中，置低溫冰箱中保存待測。

2.5 動物肺組織勻漿的制取 先將組織標本從低溫無菌樣品管中取出，在微量天平上剪取組織樣品約3 mg，在清潔的生物組織碾缽中先加入0.9%生理鹽水1 mL，放入上述肺組織樣品，反復加液氮，在液氮中迅速碾磨至組織完全粉碎，用移液器將碾缽中組織勻漿液移至清潔試管中，用0.9%生理鹽水1 mL 沖洗碾缽共2 次，將沖洗液移至清潔試管中，低溫離心2 000 r/min 共10 min，用移液器將上清液吸出移至清潔尖底管中，置低溫冰箱待檢。

2.6 觀察指標 （1）動脈血氣分析：第28 天進行血氣分析檢測，觀察動脈氧分壓（PaO2）、動脈氧飽和度（SaO2）、肺泡-動脈血氧分壓差（PA-aO2）。（2）測定TNF-α 和IFN－γ 含量：肺組織勻漿總蛋白（TP）含量測定采用雙縮脲法；肺組織勻漿TNF-α 和IFN-γ 含量測定均采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法，按照TNF-α 和IFN-γ 的ELISA 試劑盒使用說明書檢測TNF-α 和IFN-γ 的含量。TNF-α 和IFN-γ 相對含量采用其與肺組織勻漿TP 的比值來表示。

2.7 統(tǒng)計學方法 實驗數據經正態(tài)性檢驗后均以均數±標準差（s）表示。采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件，組間多樣本均數的比較經方差齊性檢驗后采用單因素方差分析，兩組間比較經q 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 肺組織標本大體觀察 第3 天正常組肺臟呈均勻粉紅色，質地柔軟；余各組肺臟粉白相間，質地稍硬，部分肺臟組織表面有出血點。第7 天正常組肺臟呈均勻粉紅色，質地柔軟；余各組肺臟粉白相間，質地稍硬，部分肺臟組織表面出現(xiàn)片狀出血。第28 天正常組和假手術組肺臟呈均勻粉紅色，質地柔軟；生地注射組和生地口服組粉白相間，肺臟表面稍見凹凸不平，但無結節(jié)，質偏硬；甲強龍注射組粉白相間，肺臟表面部分凹凸不平，有1 例肺臟表面有結節(jié)、質偏硬；模型組肺臟蒼白，體積略小，肺臟表面凹凸不平，甚至有結節(jié)，質硬。該觀察亦提示肺間質纖維化模型大鼠造模成功。

3.2 動脈血氣分析 與假手術組相比，模型組PaO2減小（P＜0.01）；與模型組相比，生地注射組PaO2增大（P＜0.05），生地口服組和甲強龍組PaO2有增大趨勢。與假手術組相比，模型組SaO2減?。≒＜0.05）；各給藥組SaO2較模型組有增大趨勢。與假手術組相比，模型組PA-aO2增大（P＜0.01）；與模型組相比，生地注射組PA-aO2減?。≒＜0.05），其余各給藥組PA-aO2有減小趨勢。正常組、假手術組兩組之間各指標均無顯著差異。見表1。

表1 第28 天各組大鼠動脈血氣分析結果比較（

表1 第28 天各組大鼠動脈血氣分析結果比較（

注：與假手術組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

3.3 肺組織勻漿TNF-α 相對含量 第3 天、第7天、第28 天，與假手術組相比，模型組TNF-α 升高（P＜0.01）；正常組、假手術組兩組之間均無顯著差異。第3 天與模型組相比，生地注射組TNF-α 降低（P＜0.05），生地口服組和甲強龍組有降低趨勢。第7天各組TNF-α 均升高，達到高峰；與模型組相比，生地注射組（P＜0.01）、生地口服組（P＜0.01）、甲強龍組（P＜0.05）均降低。第28 天各組TNF-α 均較低7天降低；與模型組相比，各給藥組均降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肺組織TNF-α 相對含量（TNF-α/TP）比較

表2 各組大鼠肺組織TNF-α 相對含量（TNF-α/TP）比較

注：與假手術組相比，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

3.4 肺組織勻漿IFN-γ 相對含量 第3 天、第7 天、第28 天，與假手術組相比，模型組IFN-γ 降低（P＜0.01）；正常組、假手術組兩組之間均無顯著差異。第3天與模型組相比，生地口服組（P＜0.05）、甲強龍組（P＜0.01）IFN-γ 升高，生地注射組有升高趨勢。第7 天各給藥組IFN-γ 較模型組有升高趨勢。第28 天與模型組相比，生地注射組和甲強龍組IFN-γ 升高（P＜0.05），生地口服組有升高趨勢。見表3。

表3 各組大鼠肺組織勻漿IFN-γ 相對含量（IFN-γ/TP）比較

表3 各組大鼠肺組織勻漿IFN-γ 相對含量（IFN-γ/TP）比較

注：與假手術組相比，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

4 討論

生地治療肺纖維化的臨床研究主要包括改善血氣分析及肺功能指標、降低TGF-β1、降低TNF-α、調節(jié)體液免疫和血液流變學；基礎研究主要包括改善肺系數及肺組織病理變化、抑制膠原表達、清除氧自由基、調節(jié)細胞因子、改善細胞外基質代謝等。

曙光醫(yī)院肺病科在以往研究工作基礎上，提出“氣絡傷”是肺纖維化病機核心的理論，“氣絡傷”即氣絡的損傷。從肺之氣絡探討肺纖維化的病機有兩方面[16]：其一為氣絡本身及功能失調；其二為邪犯氣絡，具體包括邪傷衛(wèi)氣、痰瘀伏絡、陰傷肺熱、他臟失調而內邪干肺絡。據此，肺纖維化的治療原則乃氣絡虛者宜通補、氣絡瘀者宜通、通絡宜味辛、調補他臟通絡。生地清熱養(yǎng)陰生津、補腎通痹的作用為肺纖維化的治療提供了新的方向。

在臨床肺纖維化階段，動脈血氣分析通常顯示輕度低氧血癥，但活動時彌散量減少、PA-aO2加大，使PaO2進一步降低，而動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）即使在病程后期通常能維持在正常范圍。患者低氧血癥是由通氣/血流比例失衡和彌散功能異常產生的；彌散功能異常是由于肺泡毛細血管的橫截面積減少和紅細胞通過具有功能的肺毛細血管床的單位時間過短以致不能使血紅蛋白與氧充分飽和所致[17]。我們的前期研究[14]顯示表明生地可抑制炎癥反應，減少氣道腺體分泌，促進肺泡氣體交換，從而改善PaO2和SaO2。本研究表明生地注射組在第28 天可提高PaO2、減少PA-aO2（P＜0.05）；生地口服組在改善PaO22、SaO2及PA-aO2方面顯示出優(yōu)于模型組的趨勢。提示生地提取物顯示出一定的改善肺纖維化大鼠動脈血氣分析指標的能力，且腹腔注射的給藥方式療效更加顯著。

肺纖維化的基礎是細胞因子網絡調控失衡導致大量趨化因子釋放從而引起炎性細胞聚集、活化[18]，其中TNF-α 是肺纖維化過程中起重要作用且具有廣泛生物活性的細胞因子，由巨噬細胞分泌，可參與局部損傷和炎癥反應。當肺組織損傷后，巨噬細胞募集到損傷組織周圍并被激活，釋放出TNF-α，一方面TNF-α 加重炎癥反應，另一方面能促進纖維母細胞增生，分泌大量膠原[19]?，F(xiàn)在普遍認為TNF-α 與IL-1起協(xié)同作用，激活中性粒細胞，介導了早期肺泡炎癥反應。本研究表明第7 天和第28 天，生地注射組和生地口服組可降低TNF-α（P＜0.01-0.05），提示生地提取物可使肺纖維化模型大鼠肺組織TNF-α 含量降低。

IFN-γ 由Th1 淋巴細胞和自然殺傷細胞分泌，具有強大的免疫調節(jié)作用，是一種抗纖維化的細胞因子，可拮抗Th2 細胞因子白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）等的促纖維化活性，也可拮抗TGF-β 促膠原合成作用，同時能抑制纖維母細胞合成膠原。在大鼠肺纖維化模型中，IFN-γ 可明顯抑制纖維化的進展。曾有研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ 加小劑量激素長期治療對單用激素無效的特發(fā)性肺纖維化患者，可使高表達的TGF-β1b 下調，病情得到實質性改善，肺總量、氧分壓均有明顯增加[20]。本研究表明生地注射液（第28 天）、生地口服組（第3 天）能升高IFN-γ 含量（P＜0.05），生地注射組（第3 天、第7 天）、生地口服組（第7 天、第28 天）在升高IFN-γ 方面均顯示出優(yōu)于模型組的趨勢，提示以生地提取物能使肺纖維化大鼠的肺組織IFN-γ 含量升高。

本研究結果表明生地提取物可改善肺纖維化大鼠動脈血氣分析指標，從而有效治療肺纖維化，其機制可能和抑制TNF-α 表達以及促進IFN-γ 分泌有關。