肖鐘迪，張玉成，喬 峰

(1.大慶油田總醫(yī)院 普外科，黑龍江 大慶163001；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 科學(xué)研究中心；3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胸心外科)

肝細(xì)胞癌(HCC,簡(jiǎn)稱肝癌)的惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。研究肝癌侵襲與轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物和機(jī)理，將對(duì)肝癌的治療和預(yù)后判斷至關(guān)重要[1]。microRNAs(miRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為19-22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，研究表明microRNAs參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的全過(guò)程[2,3]。但是有關(guān)miR-218與肝癌之間的相關(guān)性仍然未知。本研究將利用qRT-PCR方法檢測(cè)不同分期的肝癌組織miR-218表達(dá)的情況，結(jié)合肝癌患者生存率進(jìn)行預(yù)后判斷，結(jié)合肝癌患者生物特征與生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以明確miR-218的表達(dá)與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象本研究選取2011-2013年大慶油田總醫(yī)院普外科肝癌患者112名，均為漢族，其中男性63名，女性47名，年齡20-70歲，其中女性平均年齡47.7歲，男性平均年齡46.1歲；112例肝癌樣本中，T1期44例，T2期45例，T3期23例。所有的樣本采集均獲得了患者知情同意，檢測(cè)完全符合大慶油田總醫(yī)院倫理道德標(biāo)準(zhǔn)并通過(guò)倫理審查。

1.2 RT-qPCR檢測(cè)TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific,USA)提取RNA，提取過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后應(yīng)用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA，接著應(yīng)用TaqMan MicroRNA PCR (Thermo Fisher Scientific,USA)進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行miR-218定量分析，U6作為對(duì)照microRNA，每個(gè)樣本至少重復(fù)3次，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0進(jìn)行t檢驗(yàn)，數(shù)值用均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Kaplan-Meier生存曲線用于分析miR-218的表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 miR-218在肝癌患者中表達(dá)降低利用RT-qPCR檢測(cè)了112例肝癌患者miR-218的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，miR-218在肝癌患者中表達(dá)明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1)。

圖1 miR-218在肝癌中表達(dá)降低

2.2 miR-218的表達(dá)與肝癌患者分期等的相關(guān)性利用RT-qPCR分別檢測(cè)了不同分期肝癌患者miR-218的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，miR-218在T3期降低了86%，miR-218表達(dá)降低最大，而在T1期降低了52%，miR-218表達(dá)降低相對(duì)最小(見(jiàn)圖2A)； miR-218表達(dá)的降低與肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)(見(jiàn)圖2B和圖2C)。

2.3 miR-218的低表達(dá)與肝癌患者預(yù)后有關(guān)通過(guò)手術(shù)后患者隨訪，以miR-218表達(dá)的中位值作為截?cái)嘀颠M(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-218表達(dá)越低，肝癌患者的預(yù)后生存率越差(見(jiàn)圖3)。

3 討論

HCC是發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，其死亡率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中位列第三位，僅次于胃癌和食管癌。我國(guó)每年約有11萬(wàn)人死于肝癌，其患病率占世界的50%以上，已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康的重大疾病，值得重視。miRNAs作為一類(lèi)新型基因調(diào)控劑，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。越來(lái)越多的資料表明miRNAs在多種腫瘤中存在異常，其通過(guò)調(diào)控下游靶基因，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及血管生成等生物學(xué)特性，發(fā)揮癌基因或抑制癌基因的作用，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。

A miR-218在不同分期肝癌患者的表達(dá)情況.B miR-218在肝癌患者轉(zhuǎn)移狀況的表達(dá)情況.C miR-218在肝癌患者復(fù)發(fā)狀況的表達(dá)情況.

圖3 miR-218的低表達(dá)與肝癌患者預(yù)后關(guān)系

本研究利用qRT-PCR方法檢測(cè)了112例肝癌組織中miR-218的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，miR-218在肝癌患者中表達(dá)明顯降低；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-218在肝癌的表達(dá)隨著肝癌分期的增加而逐漸降低，其中肝癌三期降低最大，提示miR-218低表達(dá)可能與肝癌的分期有關(guān)；此外，研究還提示miR-218的低表達(dá)與肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)之間具有密切關(guān)系；miR-218表達(dá)越低，肝癌患者的預(yù)后越差。已有的研究也表明miR-218在非小細(xì)胞肺癌、腎透明細(xì)胞癌和大腸癌表達(dá)降低，并且miR-218表達(dá)的降低可能在非小細(xì)胞肺癌和腎透明細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)[4-6]；但是也有研究表明miR-218在上皮性卵巢癌中表達(dá)升高，并且miR-218的高表達(dá)與上皮性卵巢癌的分期和進(jìn)展密切相關(guān)[7]，這可能與miR-218在不同癌組織中具有差異表達(dá)有關(guān)。

總之，我們的結(jié)果顯示miR-218在肝癌中低表達(dá)，并與肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和預(yù)后密切相關(guān)。但是本研究?jī)H僅選擇了112例肝癌患者標(biāo)本，標(biāo)本量不夠大，檢測(cè)結(jié)果可能不能完全反應(yīng)miR-218與肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的相關(guān)性，另外有關(guān)miR-218參與肝癌的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。