鄭可心，張秀梅

0 引言

近年來，隨著人們生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，大腸癌在我國乃至世界的發(fā)生率顯著增加，是發(fā)病率與死亡率最高的癌癥之一[1]。已有研究證實：腫瘤細胞為滿足其快速增殖的需要，消耗大量的葡萄糖，即使在氧氣充足的條件下也主要依靠糖酵解供能，這種代謝特征被稱為Warburg效應(yīng)或有氧糖酵解[2-4]。己糖激酶（hexokinase,HK）是糖酵解的第一個關(guān)鍵酶。目前已知哺乳動物體內(nèi)有四種同工酶（HKⅠ、HKⅡ、HKⅢ和HKⅣ）。有研究表明[5-6]，腫瘤細胞中HKⅡ的活性與正常細胞相比明顯升高，導(dǎo)致腫瘤細胞在缺少氧氣的情況下仍能有足夠的能量供應(yīng)。磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway,PPP）又稱磷酸戊糖旁路。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD）是PPP的關(guān)鍵酶。該途徑的代謝產(chǎn)物為NADPH和5-磷酸核糖（ribose-5-phosphate,R-5-P）。對于快速增殖的細胞尤其是腫瘤細胞，充足的NADPH及R5P的供應(yīng)是維持其生長繁殖所必需的。已有文獻證實[7-8]：腫瘤細胞中PPP流量較正常細胞明顯提高，其主要機制是腫瘤細胞內(nèi)G6PD異常激活及表達增加。

因此，G6PD和HKⅡ可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究旨在探討G6PD對大腸癌HCT116和SW480細胞生長增殖、侵襲的影響及G6PD與HKⅡ在大腸癌組織中的表達情況及兩者的相關(guān)性，為探討大腸癌發(fā)生、發(fā)展的機制及臨床診斷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

本實驗室保存的HCT116、SW480細胞。大腸癌組織芯片包括89對癌組織和癌旁組織購自上海芯超公司。兔抗人的G6PD和HKⅡ多克隆抗體購自美國CST公司，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG、免疫組織化學(xué)二抗試劑盒、DAB染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，小干擾RNA購自上海吉瑪公司，葡萄糖氧化酶試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 細胞分組及轉(zhuǎn)染

將HCT116和SW480細胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞接種于6孔板或12孔板中，待細胞密度至60%～70%時開始轉(zhuǎn)染，進行過表達和干擾G6PD實驗。過表達實驗分為Flag空載體轉(zhuǎn)染組和Flag-G6PD轉(zhuǎn)染組，干擾實驗分為陰性對照轉(zhuǎn)染組和G6PD-Homo-318、G6PD-Homo-873、G6PDHomo-1504轉(zhuǎn)染組。6 h后更換為含有10%胎牛血清和雙抗的RPMI 1640完全培養(yǎng)液。

1.3 Western blot法檢測HCT116、SW480細胞中G6PD和HKⅡ的表達水平

轉(zhuǎn)染過程同上。G6PD過表達組于換液后48 h時收集細胞，siRNA干擾組于換液后36 h時收集細胞。將收集的細胞加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑提取總蛋白。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，各組調(diào)成相同濃度后變性完成樣品制備。將蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離，90 V 90 min轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%的脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，膜與G6PD、HKⅡ和actin抗體結(jié)合，4℃孵育過夜。經(jīng)TBST洗滌后，用二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌后ECL發(fā)光法成像。

1.4 培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的測定

G6PD過表達實驗轉(zhuǎn)染42 h，siRNA干擾實驗轉(zhuǎn)染30 h后更換完全培養(yǎng)液，換液后6 h收集培養(yǎng)液，按照葡萄糖氧化酶試劑盒說明書檢測培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度。

1.5 細胞劃痕實驗

轉(zhuǎn)染24 h后開始劃痕，PBS輕輕沖洗2次再更換培養(yǎng)液，分別在劃痕后0、48 h時顯微鏡下照相，觀察細胞的遷移能力。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

轉(zhuǎn)染過程同上。G6PD過表達組于48 h時收集細胞，siRNA干擾實驗組于36 h時收集細胞，加入預(yù)冷的75%乙醇4℃固定過夜，次日將固定好的細胞以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清液，加入1 ml PBS清洗兩次，離心后加入碘化丙錠（PI）染液，37℃避光染色30 min，流式細胞術(shù)檢測細胞周期進程。

1.7 免疫組織化學(xué)實驗

將大腸癌組織芯片置于65℃烘箱中烘蠟2 h至融化。取出玻片，以二甲苯兩缸，每缸15 min；無水乙醇兩缸，每缸7 min；90%酒精1缸，5 min；80%酒精1缸，5 min；70%酒精1缸，5 min的梯度進行脫蠟。玻片用純水沖洗。檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復(fù)。室溫下滴加3%H2O2進行阻斷。PBS沖洗后滴加G6PD、HKⅡ抗體4℃孵育過夜。孵育后的玻片室溫放置30 min后，PBS沖洗加入辣根過氧化物酶標記的相應(yīng)二抗，37℃孵育30 min。PBS沖洗后滴加稀釋后的DAB顯色液顯色5 min，自來水沖洗5 min。滴加哈氏蘇木精對比染色細胞核后，以75%酒精1缸，5 min；85%酒精1缸，5 min；95%酒精1缸，5 min；無水乙醇兩缸，每缸7 min；二甲苯兩缸，每缸15 min的梯度進行脫水。取出封片，熒光顯微鏡下觀察免疫組織化學(xué)結(jié)果。

每張切片各選5個視野，根據(jù)染色程度和染色陽性率取均數(shù)進行評分[9]。染色越深即切片陽性染色顆粒越多，反映染色陽性的G6PD和HKⅡ蛋白表達水平越高。反之則越低。按染色強度將無色、淡黃色、棕色、棕褐色分別記為0、1、2、3分。按染色陽性率將陽性細胞＜5%、5%～25%、＞25%～50%、＞50%～75%、＞75%分別記為0、1、2、3、4分。以其評分之積為最終計算結(jié)果進行賦分。總分0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，細胞實驗的蛋白表達水平、葡萄糖濃度、細胞周期及侵襲能力數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,G6PD和HKⅡ在大腸癌與癌旁組織中的表達水平及其兩者間的相關(guān)性分析均采用Mann-Whitney U-test檢驗方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot法檢測HCT116和SW480細胞中G6PD過表達和干擾效果

在G6PD過表達實驗中，與Flag轉(zhuǎn)染組相比，HCT116和SW480兩種細胞Flag-G6PD轉(zhuǎn)染組G6PD蛋白表達水平顯著升高，見圖1。提示過表達實驗Flag和Flag-G6PD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。在siRNA干擾實驗中，與陰性對照轉(zhuǎn)染組相比，HCT116和SW480兩種細胞G6PD-Homo-318轉(zhuǎn)染組無明顯變化，G6PD-Homo-873和G6PDHomo-1504轉(zhuǎn)染組G6PD蛋白表達顯著下調(diào)，而G6PD-Homo-1504轉(zhuǎn)染組下調(diào)更明顯，見圖2。之后的細胞實驗我們將利用篩選出的G 6 P DHomo-1504對細胞進行干擾。

圖1 過表達G6PD后HCT116、SW480細胞中G6PD的表達水平Figure 1 Expression levels of G6PD in HCT116 and SW480 cells after overexpression of G6PD

圖2 干擾G6PD后HCT116、SW480細胞G6PD的表達水平Figure 2 Expression levels of G6PD in HCT116 and SW480 cells after interference with siRNA

2.2 培養(yǎng)液中葡萄糖含量

在G6PD過表達實驗中，與Flag轉(zhuǎn)染組相比，F(xiàn)lag-G6PD轉(zhuǎn)染組兩種細胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度有所減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。siRNA干擾實驗中，與陰性對照轉(zhuǎn)染組相比，G6PDHomo-1504轉(zhuǎn)染組兩種細胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度顯著升高（PHCT116=0.003,PSW480=0.002），見表1。

表1 過表達和干擾G6PD后各組培養(yǎng)液中葡萄糖濃度 (±s,n=3)Table 1 Glucose concentration in culture medium after G6PD overexpression and interference (±s, n=3)

表1 過表達和干擾G6PD后各組培養(yǎng)液中葡萄糖濃度 (±s,n=3)Table 1 Glucose concentration in culture medium after G6PD overexpression and interference (±s, n=3)

Notes:#:P＞0.05,compared with Flag transfection group;**:P＜0.01,compared with Negative control transfection group

2.3 過表達和干擾G6PD后HCT116、SW480細胞細胞周期的變化

G6PD過表達實驗中，與Flag轉(zhuǎn)染組相比，F(xiàn)lag-G6PD轉(zhuǎn)染組兩種細胞S期所占比例有所增多，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。siRNA干擾實驗中，與陰性對照轉(zhuǎn)染組相比G6PD-Homo-1504轉(zhuǎn)染組兩種細胞S期所占比例明顯減少，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（PHCT116=0.02,PSW480=0.03），見圖3。

圖3 流式細胞儀檢測各組細胞周期的結(jié)果Figure 3 Cell cycle of each group detected by flow cytometry

2.4 過表達和干擾G6PD后對HCT116和SW480細胞侵襲的影響

G6PD過表達實驗中，F(xiàn)lag轉(zhuǎn)染組與Flag-G6PD轉(zhuǎn)染組兩種細胞間劃痕部分面積的縮小速率差異無明顯變化（P＞0.05）。siRNA干擾實驗中，與陰性對照轉(zhuǎn)染組相比G6PD-Homo-1504轉(zhuǎn)染組兩種細胞劃痕部分面積的縮小速率明顯降低，說明細胞侵襲能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（PHCT116=0.006,PSW480=0.002），見圖4。

2.5 G6PD與HKⅡ在大腸癌細胞及組織中的表達水平及相關(guān)性分析

Western blot檢測結(jié)果表明，與Flag轉(zhuǎn)染組相比，F(xiàn)lag-G6PD轉(zhuǎn)染組HKⅡ蛋白水平顯著升高，見圖5A～B；siRNA干擾實驗與陰性對照轉(zhuǎn)染組相比，G6PD-Homo-1504轉(zhuǎn)染組HKⅡ蛋白水平明顯下調(diào)，見圖5C～D。結(jié)果顯示G6PD與HKⅡ可能存在調(diào)控作用。免疫組織化學(xué)法檢測89對大腸癌組織芯片發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，G6PD與HKⅡ在大腸癌組織中表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（PG6PD=0.036,PHKⅡ=0.046），見圖5E。通過Mann-Whitney U test檢驗分析，G6PD和HKⅡ在大腸癌組織中的表達水平存在正相關(guān)（P=1.57×10-4），見圖5F。

圖4 過表達和干擾G6PD后兩種細胞侵襲能力 (×40)Figure 4 Invasion abilities of HCT116 and SW480 cells after G6PD overexpression and interference (×40)

圖5 G6PD和HKⅡ的表達(A～E)及在大腸癌樣本中的相關(guān)性(F) (×100)Figure 5 Expression of G6PD and HKⅡ(A～E) and their correlation in colorectal cancer samples(F) (×100)

3 討論

葡萄糖代謝的改變是腫瘤細胞為協(xié)調(diào)葡萄糖的消耗和細胞生理機能所產(chǎn)生的一個顯著的代謝特征。迅速增殖的腫瘤細胞糖酵解流量通常是正常細胞的200倍[10]。糖酵解水平的提高使腫瘤細胞對葡萄糖的消耗增多，指導(dǎo)更多的葡萄糖進入與體內(nèi)生物大分子合成密切相關(guān)的磷酸戊糖途徑。G6PD和HK分別是磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑的關(guān)鍵酶。HKⅠ和HKⅡ在多種腫瘤中高表達，并且HKⅡ與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系最為密切[11]。以HKⅡ作為治療靶點可以減少體內(nèi)腫瘤生長，包括宮頸癌和肺癌及其他腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[12-13]。G6PD對細胞生長具有重要調(diào)節(jié)作用[14]。有研究表明，G6PD是一個癌基因，在多種惡性腫瘤中表達上調(diào)[15-16]。

本實驗通過對大腸癌HCT116和SW480細胞進行過表達和干擾G6PD處理。Western blot結(jié)果證實過表達和干擾效果都很顯著。過表達實驗中，與Flag對照組相比，F(xiàn)lag-G6PD轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)液中葡萄糖濃度有所降低，S期細胞數(shù)量有所增多，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而干擾實驗中，與陰性對照轉(zhuǎn)染組相比，G6PD-Homo-1504轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)液中葡萄糖濃度明顯升高（P＜0.01），消耗的葡萄糖明顯降低，S期細胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05）。結(jié)果提示干擾G6PD減少了葡萄糖的消耗，從而抑制了細胞的增殖。已有研究表明，G6PD與皮膚鱗癌A431細胞增殖及細胞周期密切相關(guān)[17]。本研究劃痕實驗結(jié)果顯示，過表達G6PD組與對照組間無明顯變化（P＞0.05）；而G6PD干擾組細胞與陰性對照組相比，侵襲能力顯著降低（P＜0.01），結(jié)果提示我們G6PD可以促進細胞的侵襲。已有研究表明，通過敲低G6PD造成腎透明細胞癌細胞ccRCC的遷移能力顯著降低[18]。這與我們的結(jié)果相一致。

過表達G6PD后葡萄糖的攝取、細胞周期及侵襲情況變化不顯著。分析其可能原因是腫瘤細胞中G6PD的表達水平已經(jīng)足夠維持細胞需要，雖然細胞中G6PD總量以及其活性增加，但對細胞功能沒有顯著的影響，這與之前的研究一致[19]。而干擾G6PD后，降低了G6PD的活性，從而減少了細胞對葡萄糖的消耗，使糖酵解能力降低進而抑制了腫瘤細胞的生長增殖和侵襲能力。

同時本研究發(fā)現(xiàn)，過表達G6PD后HKⅡ的表達水平顯著上調(diào)，siRNA干擾G6PD的表達后HKⅡ的表達顯著下調(diào)。提示G6PD與HKⅡ的表達可能存在調(diào)控作用。因此本研究進一步分析了G6PD和HKⅡ在大腸癌組織中的表達情況。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，大腸癌組織樣本中G6PD與HKⅡ蛋白表達水平均有明顯升高（P＜0.05）。本研究也證實：89例大腸癌臨床樣本中有59例G6PD的表達水平顯著升高，有61例HKⅡ的表達水平顯著升高。重要的是，本研究證實了G6PD和HKⅡ在大腸癌組織中表達水平呈正相關(guān)。與Western blot結(jié)果一致。

綜上所述，干擾G6PD減少了大腸癌細胞葡萄糖的消耗，抑制了大腸癌細胞的增殖能力和侵襲能力；同時干擾G6PD減少了HKⅡ的表達，并且與癌旁組織相比，兩者的表達水平均顯著升高且呈正相關(guān)。因此抑制G6PD和HKⅡ的活性可能為臨床大腸癌患者提供一個可能的治療策略。關(guān)于兩者之間的具體作用機制我們正在進一步研究之中。