陳曉琳 ，張夢琳，昌牧雨，方茂成，黃楚晴，邱小燕，鄧鑫州，柯青，段奇文，駱志國

0 引言

放療是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）常見治療方法，資料顯示，約60%的患者在治療不同階段會接受放療[1-2]。然而，電離輻射可引起腫瘤細胞發(fā)生上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transitions,EMT）[3-4]，進而促進腫瘤轉移。

姜黃素（Curcumin）是從姜黃、菖蒲、莪術、郁金等姜科或者天南星科的部分植物根莖中提取的一種純天然的淡黃色酚類色素[5]。大量研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可抑制胰腺癌、膀胱癌及腎癌等細胞EMT的發(fā)生[6-8]。但姜黃素是否能夠逆轉放療誘導的NSCLC發(fā)生EMT，目前國內外尚無相關報道。

本研究擬通過體外細胞實驗探討姜黃素對電離輻射誘導的NSCLC細胞上皮間質轉化的影響，為抑制或減輕臨床上放療誘導的NSCLC腫瘤細胞轉移提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；姜黃素（貨號08511）購自美國Sigma公司；抗pan-Keratin（貨號4545）、E-cadherin（貨號14472）、N-cadherin（貨號13116）、Vimentin（貨號5741）抗體購自美國Cell Signaling公司；GAPDH一抗（貨號ANT011）及HRP標記二抗（貨號ANT019）購自武漢安特捷生物技術有限公司；蛋白裂解液、PMSF、BCA蛋白定量試劑盒購自南通碧云天生物技術研究所。

1.2 細胞株

人非小細胞肺癌A549細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.3 儀器及設備

Transwell小室（Corning公司，美國）；Fresco21 型冷凍高速離心機（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；CKX41型倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；MP-4型電泳儀及轉印槽（Bio-Rad公司，美國）；odyssey-SA型雙色紅外激光成像系統(tǒng)（上海儀濤生物儀器有限公司）；ELX800型全自動酶標儀（Biotek公司，美國）；Elekta Synergy直線加速器（Elekta公司，瑞典）。

1.4 細胞培養(yǎng)

將細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.5 電離輻射誘導EMT

用2、4、6、8、10 Gy的X射線照射A549細胞，誘導其發(fā)生上皮間質轉化，命名為A549R。每照射一次，待細胞恢復活力，能正常傳代后進行下一次照射，鋪板密度為50%。

1.6 CCK8法檢測姜黃素對A549R細胞增殖的影響

選取處于對數(shù)生長期的A549R細胞，分別以5×103個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，第二天將陳舊培養(yǎng)基吸除，分別加入含姜黃素終濃度為0、1、5、10、20、40、60、100、200 μmol/L的DMEM完全培養(yǎng)基，處理48 h后，吸棄舊培養(yǎng)基，向每孔中加入含10 μl CCK-8試劑的新鮮培養(yǎng)基，孵育2 h，用Thermo Varioskan Flash多功能讀數(shù)儀檢測波長為450 nm處細胞的OD值。實際OD值=測量OD值-背景OD值。SPSS18.0軟件計算姜黃素的IC50。

1.7 Western blot檢測蛋白的表達

收集細胞（約5×106個），按照試劑盒說明書提取蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。取20 μg總蛋白用10% SDS-PAGE膠電泳，轉膜后置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。一抗4°C孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，采用ECL化學發(fā)光試劑盒顯影。以ImagePro Plus 7.0圖像分析軟件計算灰度值，將目的蛋白與內參蛋白兩者灰度值的比值作為目的蛋白的表達量。

1.8 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

將A549R細胞接種于6孔板中，每孔接種7×105個細胞，待細胞貼壁生長至融合時（約24 h），用10 μl的槍頭在細胞層上劃出一道劃痕，PBS清洗3次，加入含0.1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于顯微鏡下捕捉0 h劃痕圖片，每組捕捉10張，待培養(yǎng)48 h后，使用顯微鏡在上次捕捉位置再進行拍照。National Instrument Vision Assistant 8.6軟件計算劃痕傷口愈合面積，愈合面積=0 h劃痕面積-48 h劃痕面積。

1.9 Transwell實驗檢測細胞遷移能力

將細胞濃度調整至3×105/ml，每個Transwell小室的上室加入細胞懸液100 μl，下室加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)細胞12 h后，用棉簽擦去膜上層細胞，使用PBS淋洗后在室溫下用甲醇固定膜下層細胞15 min。PBS清洗3次后結晶紫染色，顯微鏡照相，捕捉圖片，計數(shù)細胞。

1.10 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用完全隨機方差分析或t檢驗，經SPSS16.0軟件計算相應P值。所有實驗至少重復三次，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 A549細胞經電離輻射后細胞形態(tài)轉變?yōu)殚g質形態(tài)

A549細胞經梯度分割電離輻射后，細胞形態(tài)由橢圓形上皮細胞轉變?yōu)榧忓N形間質細胞形態(tài)，見圖1。上述結果表明，已經成功構建了非小細胞肺癌細胞A549的上皮間質轉化模型A549R。

圖1 A549細胞經分割電離輻射后的形態(tài)變化 (×200,比例尺:100 μm)Figure 1 Morphological changes of A549 cells after fractionated ionizing radiation (×200,Bar:100 μm)

2.2 A549R細胞上皮及間質標志物的表達變化水平

為進一步明確經過分割電離輻射處理的A549細胞是否發(fā)生了EMT，用Western blot法檢測了A549和A549R上皮及間質標志物的表達差異，結果顯示：上皮標志物角蛋白（pan-Keratin）表達顯著下調（F=0.743,P=0.034）；E鈣黏蛋白（Ecadherin）（F=0.987,P=0.002）、間質標志物N鈣黏蛋白（N-cadherin）（F=0.400,P=0.010）、波形蛋白（Vimentin）表達顯著上調（F=0.710,P=0.024）；Twist表達輕微上調，見圖2。

2.3 檢測姜黃素對A549R細胞抑制的IC50

用0、1、5、10、20、40、60、100、200 μmol/L的姜黃素處理A549R細胞48 h，CCK8檢測細胞增殖的情況，結果顯示，40 μmol/L的姜黃素可顯著抑制A549R細胞的增殖，見圖3，計算其IC50為34.54 μmol/L。

2.4 姜黃素逆轉A549R間質細胞形態(tài)

為了檢測姜黃素對A549R細胞形態(tài)的影響，用0、1、2、5、10、20 μmol/L姜黃素處理A549R細胞48 h，A549R細胞形態(tài)由紡錘形間質形態(tài)轉變?yōu)闄E圓形上皮形態(tài)，見圖4。其中，姜黃素濃度為20 μmol/L時最為顯著。

2.5 姜黃素對A549R細胞上皮/間質標志物表達的影響

圖2 Western blot檢測A549和A549R上皮/間質標志物表達水平的變化Figure 2 Expression levels of epithelial and mesenchymal markers in A549 and A549R cells detected by Western blot

圖3 姜黃素對A549R細胞抑制的IC50測定Figure 3 IC50of curcumin on A549R cells

經過20 μmol/L姜黃素處理，上皮標志物E-cadherin（F=0.658,P=0.028）、間質標志物Vimentin（F=0.550,P=0.016）、Twist表達顯著下調（F=0.751,P=0.010），差異均有統(tǒng)計學意義；pan-Keratin表達上調（F=0.225,P=0.048），差異有統(tǒng)計學意義；N-cadherin表達水平無明顯變化（F=0.558,P=0.865），差異無統(tǒng)計學意義。上述結果表明姜黃素可能逆轉了A549R細胞EMT，見圖5。

2.6 姜黃素抑制A549R細胞劃痕愈合能力

細胞發(fā)生EMT 的一個重要結果就是促進細胞遷移和轉移。為了驗證姜黃素是否能夠影響A549R細胞的遷移能力，進行了劃痕愈合實驗。結果顯示：1 μmol/L姜黃素并未顯著影響劃痕愈合，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.944,P=0.909）；2 μmol/L（F=0.972,P=0.018）、5μmol/L（F=0.678,P=0.003）、10 μmol/L（F=0.995,P=0.000）、20 μmol/L（F=0.401,P=0.000）的姜黃素處理后，愈合面積隨姜黃素濃度的升高而顯著降低，見圖6。這表明姜黃素可顯著抑制A549R細胞的遷移能力。

圖4 光學顯微鏡觀測姜黃素對A549R細胞形態(tài)的影響(×200)Figure 4 Effect of curcumin on morphology of A549R cells observed by optical microscope(×200)

圖5 Western blot檢測姜黃素對A549R細胞上皮/間質標志物表達的逆轉作用Figure 5 Reversal effects of curcumin on expression of epithelial and mesenchymal markers in A549R cells detected by Western blot

2.7 姜黃素抑制A549R細胞遷移能力

Transwell實驗結果顯示:1 μmol/L姜黃素并未顯著影響細胞遷移能力，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.751,P=0.766）；2 μmol/L（F=0.503,P=0.002）、5 μmol/L（F=0.861,P=0.001）、10 μmol/L（F=0.861,P=0.000）、20 μmol/L（F=0.503,P=0.000）的姜黃素處理后，細胞遷移能力顯著下降，且遷移能力隨姜黃素濃度的升高而顯著下降，見圖7。進一步表明姜黃素可顯著地抑制A549R細胞的遷移能力。

3 討論

肺癌是世界上發(fā)病率及死亡率較高的惡性腫瘤之一，其中NSCLC發(fā)病率占肺癌總數(shù)的80%～85%[9]。放療是NSCLC的常見治療方法。然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，電離輻射可引起腫瘤細胞發(fā)生EMT，進而獲得高遷移和侵襲能力，形成遠處轉移灶[3]。本研究發(fā)現(xiàn)經分割輻射處理的NSCLC A549細胞形態(tài)由不利于腫瘤細胞轉移的橢圓形轉變?yōu)橛欣谀[瘤細胞轉移的紡錘形間質細胞形態(tài)，其上皮/間質標志物pan-Keratin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Twist表達水平也顯著下調或上調，提示NSCLC放療有增加腫瘤轉移的風險。對于NSCLC患者來說，腫瘤轉移是影響其長期生存的最大危險因素之一，因此，探尋放療誘導的腫瘤轉移的分子機制及逆轉策略是當前要重點關注的問題。

姜黃素在逆轉腫瘤細胞EMT的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用[5-6,10]。本研究證實，姜黃素能夠顯著逆轉放療誘導的NSCLC A549細胞發(fā)生EMT，經姜黃素處理后，A549R細胞形態(tài)由紡錘形間質形態(tài)轉變?yōu)闄E圓形上皮形態(tài)，間質標志物N-cadherin無變化、Vimentin、Twist表達顯著下調，上皮標志物E-cadherin的表達也發(fā)生下調。E-cadherin作為一個上皮標志物在發(fā)生EMT過程表達會下調,然而在本研究中細胞形態(tài)發(fā)生顯著EMT的A549R細胞E-cadherin卻顯著上調，經過多次重復實驗，我們確認結果無誤。通過查閱大量文獻發(fā)現(xiàn)E-cadherin是鈣黏素家族中的一員，分子量約為120 kD，屬于鈣依賴性跨膜糖蛋白，在上皮細胞多有表達[11]。E-cadherin作為一種細胞膜蛋白，在α-分泌酶ADAMs、基質金屬蛋白酶MMPs、激肽釋放酶7等共同催化作用下，將成熟的E-cadherin剪切成N端80 kD胞外片段（可溶性E-cadherin，sEcadherin）和C端38 kD胞內片段[12]。sE-cadherin在NSCLC患者血清中含量明顯髙于正常組，且與腫瘤遠處轉移正相關[13]。因此，E-cadherin對細胞遷移和（或）轉移的作用可能是復雜的，本研究中E-cadherin在A549細胞發(fā)生EMT過程中表達上調可能并不是一種矛盾現(xiàn)象。在經典的EMT現(xiàn)象中E-cadherin表達下調，而本研究發(fā)現(xiàn)的可能是一種新的、非經典的EMT現(xiàn)象，將為重新審視EMT標志物，以及E-cadherin在EMT中的作用提供重要學術參考價值。由于本研究未對其進行深入的功能和機制研究，此種EMT現(xiàn)象與經典的EMT現(xiàn)象的功能和分子機制差異還不清楚。

圖6 劃痕愈合實驗檢測姜黃素對A549R細胞遷移能力的影響 (×200，比例尺:100 μm)Figure 6 Effects of curcumin on migration ability of A549R cells detected by scratch healing assay (×200,Bar:100 μm)

圖7 Transwell實驗檢測姜黃素對A549R細胞遷移能力的影響 (×200，比例尺:100 μm)Figure 7 Effects of curcumin on migration of A549R cells detected by Transwell assay (×200,Bar:100 μm)

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了一種非經典的EMT現(xiàn)象，結果顯示姜黃素通過下調E-cadherin、Vimentin、Twist的表達，并上調pan-Keratin的表達，從而逆轉電離輻射誘導的NSCLC細胞發(fā)生EMT，有望為克服臨床上電離輻射誘導的NSCLC細胞發(fā)生EMT提供了一種新思路。