孫慧，陳風(fēng)，劉東洋，史珂，彭晴

0 引言

胃癌是一種消化道惡性腫瘤，目前仍然是一種重要的全球性癌癥[1-3]，是世界第五大常見癌癥，第三大癌癥死亡原因[4-5]。2018年新發(fā)現(xiàn)超過1 000 000新病例，并預(yù)計(jì)會(huì)有783 000例胃癌患者面臨死亡。其中男性患者是女性患者的兩倍。在最新發(fā)布的2016年中國城市惡性腫瘤中，胃癌位于第二位，僅次于肺癌[4]。由于早期癥狀缺乏特異性，大部分患者確診已處于中晚期。胃癌的高發(fā)病率已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類健康，尤其是東亞地區(qū)的中國，胃癌死亡率始終居高不下[4]。目前胃癌發(fā)病機(jī)制仍不明確[6]，因此，對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展具體機(jī)制的研究十分迫切。

Anillin（ANLN）是一種編碼肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的基因，被認(rèn)為是細(xì)胞分裂的重要組成部分[7]。ANLN蛋白是參與有絲分裂/胞質(zhì)分裂的蛋白簇，是卵裂溝的一部分[8]。近來研究發(fā)現(xiàn)ANLN參與到多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲[9-13]。本研究通過沉默ANLN基因，研究其對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 資料

人胃癌細(xì)胞系MGC-803、SGC-7901與正常胃黏膜細(xì)胞GES-1購自中國科學(xué)院上海生命研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

胎牛血清（FBS）、Opti-MEM和RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；細(xì)胞裂解液RIPA、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA檢測(cè)試劑盒及DAPI染液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；qRT-PCR引物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；凋亡試劑盒購自美國BD公司；TRITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)獲取 從TCGA（https://cancergenome.nih.gov/）、Oncomine（https://www.oncomine.org/resource/main.html）和Xena Kaplan-Meier Plot Help（https://xena.ucsc.edu/survivalplots/）數(shù)據(jù)庫獲取231例胃腺癌及胃管狀腺癌組織中ANLN表達(dá)量相關(guān)生存率情況的數(shù)據(jù)。從Oncomine（https://www.oncomine.org/resource/main.html）獲取51例彌漫性胃癌及胃組織中ANLN表達(dá)量數(shù)據(jù)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞SGC-7901、MGC-803及正常胃黏膜GES-1細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中（含8%胎牛血清（FBS）），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，用0.25%含EDTA的胰酶溶液進(jìn)行常規(guī)消化。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)基中加入1%青霉素（100 u/ml）和鏈霉素（0.1 mg/ml）。每2天換液，3天傳代一次。

1.3.3 siRNA合成與轉(zhuǎn)染 由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成3條ANLN基因的編碼區(qū)siRNA片段（siANLN-1、siANLN-2、siANLN-3），見表1。將MGC-803、SGC-7901細(xì)胞按每孔1×105個(gè)細(xì)胞分別鋪板六孔板。用不含抗生素的8%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)至貼壁，融合度達(dá)70%～90%時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6 h更換新的不含抗生素的8%胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。siRNA干擾的MGC-803細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的MGC-803細(xì)胞分別作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

表1 ANLN基因干擾siRNA序列Table 1 Interfering sequences of siRNA of ANLN gene

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用TRIzol提取細(xì)胞中的總RNA，測(cè)定RNA的濃度和純度。通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄完成后的cDNA稀釋3～5倍，以其為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參，引物序列見表2。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 3 s，62℃ 30 s，72℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Primer sequences for qRT-PCR

1.3.5 蛋白質(zhì)提取與Western blot檢測(cè) 向六孔板細(xì)胞加入100 μl細(xì)胞裂解液（RIPA:PMSF=100:1），搜集細(xì)胞裂解液加入SDS上樣緩沖液，煮沸10 min。電泳，轉(zhuǎn)膜至NC膜上，10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗室溫孵育2 h，二抗室溫孵育1 h，ECL顯影拍照?？贵wANLN購于美國Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠或山羊抗兔IgG購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Western blot結(jié)果通過Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞按每孔加入5×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板并培養(yǎng)24 h；貼壁后轉(zhuǎn)染24 h，用200 μl槍頭垂直孔板上畫線；PBS洗去懸浮細(xì)胞，RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按0、24、48 h取樣拍照。根據(jù)劃痕距離計(jì)算細(xì)胞遷移速率。

1.3.7 Transwell實(shí)驗(yàn) 在24孔Transwell板上室加入80 μl基質(zhì)膠（用無血清培養(yǎng)液按1:3稀釋），放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱4 h；上室種植細(xì)胞密度為每孔2×105個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)開始后使用無血清的培養(yǎng)基；下室使用完全培養(yǎng)基；置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)8 h后，上室棄去培養(yǎng)基，小心取出上室，擦去膜上未穿膜的細(xì)胞，40 g/L多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞，記錄穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3.8 CCK-8法檢測(cè)增殖實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后24 h取細(xì)胞，按每孔5 000個(gè)細(xì)胞種植在96孔板中，置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別在0、1、2、3天每孔加10 μl CCK-8試劑，2 h后酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長處的光密度。

1.3.9 細(xì)胞熒光染色實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后24 h取細(xì)胞，PBS清洗2次后固定；Triton X-100溶液透化處理；TRITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色30 min；DAPI染色30 s；熒光顯微鏡下拍照。

1.3.10 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后24 h取細(xì)胞，PBS清洗后70%乙醇固定，PI染色后常溫避光30 min上機(jī)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.3.11 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞，離心去上清液；用PI和FITC染料染色，常溫避光15 min后在0.5 h內(nèi)上機(jī)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組均數(shù)間的比較用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ANLN異常表達(dá)影響胃癌生存率

從TCGA/Oncomine/Xena Kaplan-Meier plot help數(shù)據(jù)庫中獲取的231例ANLN與胃癌生存率的數(shù)據(jù)顯示ANLN高表達(dá)顯著降低胃癌患者的總生存期，見圖1。

2.2 胃癌組織、胃癌細(xì)胞株中的ANLN表達(dá)量顯著高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞

從Oncomine數(shù)據(jù)庫上獲取的51例彌漫性胃癌組織（31例）和正常胃組織（20例）中ANLN的表達(dá)量數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示與正常胃組織相比，胃癌組織中ANLN的表達(dá)顯著高于正常組織，見圖2A。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞株中的ANLN表達(dá)量顯著高于胃黏膜細(xì)胞（P＜0.05），見圖2B。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫獲取231例胃腺癌及胃管狀腺癌生存情況Figure 1 Survival of 231 cases of gastric adenocarcinoma and gastric tubular adenocarcinoma obtained from TCGA database

圖2 Oncomine獲取的51例彌漫性胃癌和正常胃組織(A)及GES-1、SGC-7901、MGC-803細(xì)胞株(B)中ANLN的表達(dá)情況Figure 2 Expression of ANLN in 51 cases of diffuse gastric cancer and normal gastric tissues obtained by Oncomine(A)and GES-1,SGC-7901,MGC-803 cell lines(B)

2.3 瞬轉(zhuǎn)后ANLN的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著下降

為驗(yàn)證干擾效率，將3條siRNA干擾片段轉(zhuǎn)染到MGC-803細(xì)胞后，通過Western blot和qRT-PCR對(duì)干擾效率進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中蛋白表達(dá)量和mRNA均顯著降低，見圖3。結(jié)果證明3條siRNA可以沉默后續(xù)實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組的ANLN基因（均P＜0.01）。

2.4 敲減胃癌細(xì)胞株中ANLN基因能夠降低細(xì)胞的遷移、侵襲能力

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)ANLN 敲減后，MGC-803細(xì)胞遷移能力顯著降低（siANLN-1:P=0.0011;siANLN-2:P=0.0060;siANLN-3:P=0.0050），見圖4A。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：24 h后siANLN-1、siANLN-2和siANLN-3的細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)分別為：（68.3±27.5）、（56.6±2.8）、（36.6±2.8）個(gè)，對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)為（130±30）個(gè)（siANLN-1:P=0.0154;siANLN-2:P=0.0060;siANLN-3:P=0.0013），見圖4B。兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 qPCR(A)和Western blot(B)分析siANLN-1、siANLN-2和siANLN-3轉(zhuǎn)染效率Figure 3 Transfection efficiency of siANLN-1,siANLN-2 and siANLN-3 analyzed by qPCR(A) and Western blot(B)

2.5 下調(diào)胃癌細(xì)胞株中ANLN表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：G1期細(xì)胞顯著下降，S期細(xì)胞顯著升高，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001），見圖5A。染色結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，大多數(shù)敲減ANLN基因的細(xì)胞出現(xiàn)兩個(gè)細(xì)胞核分不開的情況，見圖5B。凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)照組和干擾組凋亡率分別為16.9%、26.5%、27.6%及18.3%，干擾組凋亡率明顯高于對(duì)照組，見圖5C。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示：敲減ANLN對(duì)MGC-803細(xì)胞的增殖具有抑制作用（均P＜0.0001），見圖5D。

2.6 下調(diào)ANLN基因表達(dá)能夠抑制正常胃黏膜細(xì)胞GES-1凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：下調(diào)ANLN基因能夠抑制GES-1細(xì)胞的凋亡，對(duì)照組與干擾組的凋亡率分別為：39.4%、15.8%和21.4%（siANLN-2:P=0.002;siANLN-3:P=0.005），見圖6A。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的敲減效果顯著（P＜0.0001），見圖6B。

3 討論

胃癌是常見的消化道腫瘤，目前的主要治療手段為手術(shù)切除、放療和化療，治療和預(yù)后效果都不理想，所以胃癌的診斷及預(yù)后評(píng)估面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，不管是WHO分型還是Lauren分型系統(tǒng)都不能充分評(píng)估患者的預(yù)后，因而尋找同預(yù)后有關(guān)的分子對(duì)于胃癌患者的干預(yù)有著重要指導(dǎo)意義[14]。

圖4 倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染48h后ANLN基因沉默對(duì)細(xì)胞遷移的影響(A ×10)及轉(zhuǎn)染24h后ANLN基因沉默對(duì)細(xì)胞侵襲影響(B ×40)Figure 4 Effect of ANLN gene silencing migration of gastric cancer cells 48h after transfection(A ×10) and cell invasion 24h after transfection(B ×40) observed by inverted microscope

圖5 ANLN基因沉默對(duì)MGC-803細(xì)胞周期(A)、細(xì)胞核和肌動(dòng)蛋白染色情況(B)、凋亡(C)和增殖(D)的影響Figure 5 Cell cycle(A),staining of nucleus and actin(B),apoptosis(C)and proliferation(D) of MGC-803 cells after ANLN gene silencing

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ANLN基因沉默后細(xì)胞凋亡情況(A)及qPCR檢測(cè)siANLN-2與siANLN-3在GES-1細(xì)胞中的沉默效率(B)Figure 6 Cell apoptosis after ANLN gene silencing detected by flow cytometry(A) and silencing efficiency of siANLN-2 and siANLN-3 in GES-1 cells detected by qPCR(B)

ANLN蛋白是一類肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，它能夠與GTP-Rho[15]、F-肌動(dòng)蛋白[16]及隔膜蛋白[17]等結(jié)合，影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)ANLN在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在膀胱癌中，ANLN表達(dá)下調(diào)顯著降低細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，還能改變細(xì)胞的周期[9]。在肝癌中，ANLN基因能夠提高肝細(xì)胞多倍體細(xì)胞，從而有效防止抑癌基因的丟失[10,18]。白血病中，ANLN可以與ETV6融合。ETV6基因編碼ETS家族的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與了血液學(xué)惡性腫瘤和其他腫瘤中大量的染色體重排。ETV6與ANLN融合后會(huì)增強(qiáng)ANLN的功能，使細(xì)胞增殖顯著增強(qiáng)，很有可能促進(jìn)了白血病的發(fā)展[13,19]。以上研究說明ANLN作為腫瘤預(yù)后標(biāo)志物具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。然而，Pandi等[20]研究報(bào)道，通過芯片篩選胃癌相關(guān)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的有關(guān)蛋白，證明了ANLN的存在。ANLN在胃癌組織中的表達(dá)同臨床預(yù)后間的關(guān)系及功能研究未見有關(guān)報(bào)道。既往關(guān)于ANLN在腫瘤細(xì)胞中的功能研究主要集中在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期，隨著ANLN在細(xì)胞間緊密連接作用的發(fā)現(xiàn)，ANLN在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡等方面的研究值得進(jìn)一步探索。

本研究獲取的數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)提示，胃癌組織中ANLN基因的表達(dá)顯著高于胃正常組織。在胃癌組織中，ANLN高表達(dá)會(huì)降低患者的生存率，提示ANLN基因可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。ANLN基因的敲減顯著降低MGC-803細(xì)胞的遷移、侵襲能力，這可能是由于ANLN蛋白的AH域?qū)hoA是十分必要的，通過調(diào)控ANLN的表達(dá)能夠直接調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)GTP-Rho的表達(dá)量，進(jìn)而直接影響細(xì)胞的遷移和侵襲。另外本研究還發(fā)現(xiàn)下調(diào)ANLN基因不僅會(huì)抑制MGC-803細(xì)胞的增殖能力，還能進(jìn)一步促進(jìn)MGC-803細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)表明，MGC-803細(xì)胞敲減后G1期細(xì)胞所占百分比顯著下降，而S期細(xì)胞所占百分比顯著升高?？赡苁茿NLN基因沉默后將細(xì)胞阻滯在S期，阻礙細(xì)胞周期發(fā)展，由于缺少ANLN蛋白與F-肌動(dòng)蛋白的結(jié)合，使S期細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白的收縮作用降低，而停留在S期的細(xì)胞需要更多的能量來使細(xì)胞分裂開，細(xì)胞自身能量供給不足抑制了細(xì)胞的增殖，最終使細(xì)胞走向了凋亡。

綜上所述，下調(diào)胃癌細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白ANLN的表達(dá)會(huì)顯著降低細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力。ANLN可能在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，有希望成為治療胃癌的新的靶點(diǎn)。