,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030;2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院,黑龍江哈爾濱 150028)

氟喹諾酮類藥物主要有諾氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、依諾沙星和氧氟沙星等。環(huán)丙沙星人類、牲畜使用最廣泛的第三代氟喹諾酮類藥物,抗菌譜廣,對(duì)革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌作用極強(qiáng)[1],Machuca等[2]發(fā)現(xiàn)在1.0 μg/mL的環(huán)丙沙星脅迫下,大腸桿菌會(huì)受到中度DNA損傷。不適當(dāng)?shù)膭┝?、不良的依從性和低質(zhì)量濃度抗生素的頻繁使用,導(dǎo)致在人類、牲畜體內(nèi)和環(huán)境中均出現(xiàn)了抗生素殘留的問題[3-4]。當(dāng)人體攝入有抗生素殘留的食物或長期不當(dāng)?shù)胤每股貢r(shí),其腸道菌群微生態(tài)會(huì)遭到破壞。Carman等[5]研究表明當(dāng)環(huán)丙沙星劑量水平低于1.5 mg/人/d的傳統(tǒng)閾值A(chǔ)DI(每日允許攝入量)時(shí),都會(huì)改變體外模型系統(tǒng)中人腸道菌群的生態(tài)學(xué)。而益生菌能夠調(diào)節(jié)人體腸道微生物群的代謝活動(dòng),改善宿主的健康,因此可以開發(fā)一類具有抵御抗生素脅迫能力、保持腸道菌群微生態(tài)平衡的益生菌制劑。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)為革蘭氏陽性菌,與動(dòng)物性乳酸菌相比,具有更強(qiáng)的耐酸和耐膽鹽能力,且能在缺乏營養(yǎng)的惡劣環(huán)境下生存,所以在人體腸道存活率更高,定植能力更強(qiáng)[6]。植物乳桿菌的潛在益處包括保持腸道菌群、平衡調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等[7]。靳志敏等[8]通過動(dòng)物模型試驗(yàn)證實(shí)了植物乳桿菌對(duì)腸道內(nèi)致病菌有一定的抑制作用,能在一定程度上調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡。鑒于其自身的益生和生物學(xué)特性,植物乳桿菌被廣泛應(yīng)用于酸奶等發(fā)酵食品中,是食品工業(yè)中最通用的菌種之一,同時(shí)也存在于人體胃腸道中。抗生素殘留、極端溫度、pH、滲透壓等外界環(huán)境的脅迫,均可能影響植物乳桿菌菌體細(xì)胞的生理狀態(tài)和性質(zhì)[9-10]。

近年來,國內(nèi)外學(xué)者主要致力于研究致病菌在環(huán)丙沙星作用下的生理特性、抑菌特性、耐藥機(jī)制等[11-14],而對(duì)于乳酸菌則主要圍繞其耐環(huán)丙沙星的機(jī)制及耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移進(jìn)行研究[15-16]。除了陳霞等[17]探究了環(huán)丙沙星對(duì)嗜熱鏈球菌生理特性的影響之外,國內(nèi)外在環(huán)丙沙星對(duì)乳酸菌脅迫應(yīng)激方面的研究未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)選用一株來源于人體腸道的植物乳桿菌作為目的菌株,使用一種氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星對(duì)其進(jìn)行主動(dòng)脅迫。實(shí)驗(yàn)組環(huán)丙沙星濃度的設(shè)置參照其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及我國規(guī)定的環(huán)丙沙星的ADI[18],設(shè)置實(shí)驗(yàn)組環(huán)丙沙星質(zhì)量濃度為0.1、0.5、2.0 μg/mL,以不含環(huán)丙沙星作為空白對(duì)照,探究植物乳桿菌在環(huán)丙沙星脅迫下的應(yīng)激反應(yīng),并考慮在適當(dāng)劑量的環(huán)丙沙星脅迫下是否具有誘導(dǎo)其產(chǎn)品主動(dòng)響應(yīng)不良脅迫的能力,為開發(fā)有效腸道益生菌的制劑產(chǎn)品提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)ZLC-18 保藏于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部乳品科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;MRS液體培養(yǎng)基 配制方法參照《乳品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》;環(huán)丙沙星化學(xué)對(duì)照品 含量≥88.5%,購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司;嵌二萘 純度≥99%,廣州偉伯科技有限公司;LIVE/DEAD?BacLightTM細(xì)菌活性檢測(cè)試劑盒 美國賽默飛世爾科技公司;丙酮酸激酶(PK)、己糖激酶(HK)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;無水乙醇及其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

SPX-150B Ⅲ生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司;Smart SpecTM plus分光光度計(jì) 美國Bio-Rad公司;5804R低溫冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;XH-T型渦旋振蕩器 金壇市醫(yī)療儀器廠;JY98-IIIN超聲破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;EVOS FL Auto 2智能全自動(dòng)熒光顯微成像系統(tǒng) 美國賽默飛世爾科技公司;RF-5301PC熒光分光光度計(jì) 日本島津公司;SU-8010場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化與培養(yǎng) 將保存于-20 ℃的植物乳桿菌甘油凍存管取出,在室溫中融化后按2%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h,傳代2～3次,保證菌液中活菌數(shù)達(dá)1×109CFU/mL。

1.2.2 環(huán)丙沙脅迫下植物乳桿菌的存活率測(cè)定 收集對(duì)數(shù)生長末期的植物乳桿菌菌體,細(xì)胞經(jīng)無菌PBS(0.2 moL/L,pH7.2～7.4)洗滌兩次后,分別重懸于等體積且含不同質(zhì)量濃度環(huán)丙沙星(0.1、0.5、2.0 μg/mL,以不含環(huán)丙沙星作對(duì)照)的MRS培養(yǎng)基中,脅迫處理0～4 h。脅迫后的菌懸液經(jīng)生理鹽水洗滌兩次后重懸于等體積生理鹽水中,稀釋不同梯度后于MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布。37 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn),每次試驗(yàn)三個(gè)平行樣品。存活率按以下公式計(jì)算[19]。

式中:NA為t小時(shí)未添加環(huán)丙沙星的活菌數(shù);NB為環(huán)丙沙星脅迫處理t小時(shí)下的活菌數(shù)。

1.2.3 環(huán)丙沙星脅迫處理實(shí)驗(yàn) 離心(4000 r/min,10 min)收集生長至對(duì)數(shù)末期的植物乳桿菌菌體,用PBS清洗兩次并重懸于等體積且含不同質(zhì)量濃度環(huán)丙沙星(0.1、0.5、2.0 μg/mL,以不含環(huán)丙沙星作對(duì)照)的MRS液體培養(yǎng)基中,脅迫處理4 h,調(diào)至OD600=0.8,PBS清洗兩次后,重懸于等體積PBS溶液中,混勻后得到菌懸液,作為待測(cè)樣。

1.2.4 環(huán)丙沙星脅迫下植物乳桿菌細(xì)胞膜完整性的測(cè)定 使用The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits測(cè)定菌體細(xì)胞膜完整性。將一個(gè)A組份移液管(SYTO 9染料)和一個(gè)B組份移液管(PI染料)的內(nèi)容物共同溶解于5 mL滅菌的去離子水中,即為LIVE/DEAD BacLight染色試劑混合物的2×儲(chǔ)備溶液。將2×儲(chǔ)備溶液的樣品與等體積1.2.3制備得到的待測(cè)樣混合。室溫下充分混合并在黑暗條件下孵育15 min。在載玻片和18 mm方蓋玻片之間滴加5 μL染色的細(xì)菌懸浮液,于熒光顯微鏡下觀察[20]。

1.2.5 環(huán)丙沙星脅迫下植物乳桿菌細(xì)胞膜流動(dòng)性的測(cè)定 細(xì)胞膜側(cè)向擴(kuò)散速率按照Aricha等[21]的方法進(jìn)行,1.2.3制備得到的待測(cè)樣取20 mL,用0.25%(V/V)的甲醛在37 ℃下固定30 min,菌體用0.2 mol/L的磷酸緩沖液(pH7.4,含0.25%甲醛)離心洗滌兩次。菌體細(xì)胞于37 ℃下,用0.1～0.5 μmol/L嵌二萘標(biāo)記40 min后,用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長為335 nm,發(fā)射波長為373 nm(單體)和470 nm(二聚體),狹縫均為5 nm。根據(jù)熒光探針濃度和470 nm波長處熒光強(qiáng)度和373 nm波長處熒光強(qiáng)度的比值作圖,斜率即為側(cè)向擴(kuò)散速率Ka。

1.2.6 環(huán)丙沙星脅迫對(duì)植物乳桿菌菌體形態(tài)的掃描電鏡觀察 將不同濃度環(huán)丙沙星脅迫處理4 h后的菌液,于4 ℃條件下、4000 r/min離心10 min,棄去上清液,收集菌體沉淀。將收集好的菌體沉淀置于4 ℃冰箱中并用2.5%的戊二醛(pH6.8)固定1.5 h以上,經(jīng)0.1 moL/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)沖洗三次后,分別用濃度為50%、70%、90%的乙醇脫水處理10 min,再用100%乙醇和叔丁醇混合液(1∶1)、純叔丁醇分別置換15 min,然后將樣品放入-20 ℃冰箱冷凍30 min,接著放入ES-2030(HITACHI)型冷凍干燥儀干燥4 h。最后經(jīng)粘樣、鍍膜后,將處理好的樣品放入樣品盒中待檢,在場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下,觀察環(huán)丙沙星脅迫前后菌體形態(tài)的變化[22]。

1.2.7 環(huán)丙沙星脅迫對(duì)丙酮酸激酶(PK)、己糖激酶(HK)、乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響研究

1.2.7.1 環(huán)丙沙星反復(fù)脅迫處理實(shí)驗(yàn) 用0.5 μg/mL環(huán)丙沙星反復(fù)脅迫植物乳桿菌三次,脅迫方法同1.2.3。之后收集生長至對(duì)數(shù)末期的植物乳桿菌菌體,用PBS清洗兩次后,重懸于含0.5 μg/mL環(huán)丙沙星的MRS液體培養(yǎng)基中,脅迫處理4 h,調(diào)至OD600=0.8,PBS清洗兩次后重懸于等體積PBS溶液,混勻后得到菌懸液,作為待測(cè)樣。

1.2.7.2 相關(guān)酶活性的測(cè)定 將1.2.3及1.2.7.1制備得到的待測(cè)樣收集至離心管內(nèi),4 ℃、8000 r/min離心10 min后棄上清,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106CFU/mL,加入1 mL提取液,在冰浴條件下超聲波破碎細(xì)胞(功率20%,超聲3 s,間隔10 s,重復(fù)30次),4 ℃、8000 r/min離心10 min,取上清,置冰上用于相關(guān)酶活的測(cè)定,其中從1.2.3制備的待測(cè)樣中提取的上清液用于丙酮酸激酶(PK)、己糖激酶(HK)、乳酸脫氫酶(LDH)的測(cè)定,從1.2.7.1制備的待測(cè)樣中提取的上清液僅用于乳酸脫氫酶(LDH)的測(cè)定。參照考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[23]。丙酮酸激酶(PK)、己糖激酶(HK)、乳酸脫氫酶(LDH)的測(cè)定均使用北京索萊寶科技有限公司提供的相應(yīng)試劑盒測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 8.0軟件作圖。所有試驗(yàn)重復(fù)三次,在SPSS 21.0里用One Way ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)方差的顯著性差異分析,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)丙沙星脅迫下植物乳桿菌的存活率

根據(jù)環(huán)丙沙星的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及我國規(guī)定的環(huán)丙沙星的ADI,本文實(shí)驗(yàn)組設(shè)置環(huán)丙沙星的質(zhì)量濃度為0.1、0.5、2.0 μg/mL,這三個(gè)濃度涵蓋了我國規(guī)定的環(huán)丙沙星的ADI可能到達(dá)人體結(jié)腸的量[24],所以選擇上述濃度進(jìn)行植物乳桿菌存活率測(cè)定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖1所示,植物乳桿菌在不同濃度環(huán)丙沙星脅迫處理0～4 h期間,存活率整體呈下降趨勢(shì)。0.1 μg/mL環(huán)丙沙星脅迫下,在0～2 h期間,菌體存活率下降幅度較大,而2～4 h間菌體存活率下降趨勢(shì)逐漸趨于緩和,4 h時(shí)菌體存活率為62.14%;經(jīng)0.5 μg/mL環(huán)丙沙星脅迫處理2 h時(shí),與0.1 μg/mL環(huán)丙沙星脅迫相比,菌體存活率大幅度下降,2 h時(shí)其存活率下降了42.76%,2～4 h間菌體存活率下降幅度不大,4 h時(shí)菌體存活率為50.65%;經(jīng)2.0 μg/mL環(huán)丙沙星脅迫1 h時(shí),菌體存活率就下降了45.21%,表明高劑量組環(huán)丙沙星脅迫下,能迅速啟動(dòng)菌體細(xì)胞死亡,菌體生長受到了明顯的抑制作用,在1～4 h間,菌體存活率小幅度下降后最終趨于平緩,4 h時(shí)菌體存活率僅為40.21%。同時(shí)可以看出,環(huán)丙沙星濃度增大,菌體存活率降低,即環(huán)丙沙星濃度越大,其對(duì)菌體的抑制作用越明顯。

圖1 環(huán)丙沙星脅迫下植物乳桿菌的存活率Fig.1 Survival rate of Lactobacillus plantarumin the presence of ciprofloxacin

環(huán)丙沙星脅迫植物乳桿菌期間表現(xiàn)出對(duì)菌體高效的抑制作用。環(huán)丙沙星在細(xì)菌細(xì)胞中具有2種酶靶標(biāo)—DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV,其通過細(xì)胞膜進(jìn)入菌體細(xì)胞后,通過干擾促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶,誘導(dǎo)雙鏈斷裂,抑制DNA的再連接,誘導(dǎo)DNA損傷,最終啟動(dòng)了菌體細(xì)胞的死亡[25]。盡管環(huán)丙沙星是有效的殺菌抗生素,但它達(dá)不到完全滅菌作用。一部分植物乳桿菌因環(huán)丙沙星迅速死亡,但仍有一部分未死亡[26]。Smith等[27]研究了0～2.0 μg/mL環(huán)丙沙星對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌作用,發(fā)現(xiàn)隨著環(huán)丙沙星濃度增大,金黃色葡萄球菌活菌數(shù)下降。這與本文中植物乳桿菌在不同濃度環(huán)丙沙星脅迫下存活率的變化基本吻合。

2.2 環(huán)丙沙星脅迫對(duì)植物乳桿菌細(xì)胞膜完整性的影響

細(xì)胞膜在細(xì)胞生長、代謝、能量傳導(dǎo)和維持恒定的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中發(fā)揮著重要作用。然而,它也是環(huán)境脅迫引起損害的主要目標(biāo)。盡管脅迫條件導(dǎo)致膜脂質(zhì)的組織、動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化,但是細(xì)胞質(zhì)膜的完整性和有效性是維持細(xì)胞活力及其代謝活動(dòng)的關(guān)鍵因素[28]。環(huán)丙沙星脅迫會(huì)改變菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的脂質(zhì)層和肽聚糖的含量,并破壞其結(jié)構(gòu),從而使環(huán)丙沙星進(jìn)入細(xì)胞壁,進(jìn)一步作用于菌體細(xì)胞膜[29]。

The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits可用于監(jiān)測(cè)以細(xì)胞膜完整性為基礎(chǔ)的菌群活性。被認(rèn)為已死或?qū)⑺赖?、?xì)胞膜受損的細(xì)胞會(huì)染成紅色,而細(xì)胞膜完好的細(xì)胞會(huì)染成綠色。環(huán)丙沙星脅迫處理對(duì)植物乳桿菌細(xì)胞膜完整性的影響結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明:對(duì)照組(圖2A)在觀察視野里幾乎全表現(xiàn)為綠色熒光,即對(duì)照組的細(xì)胞膜均保持完整,幾乎未受到破壞;經(jīng)質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL的環(huán)丙沙星處理4 h后的植物乳桿菌(圖2B)在觀察視野里有少數(shù)表現(xiàn)為紅色熒光,大部分表現(xiàn)為綠色熒光,說明0.1 μg/mL的環(huán)丙沙星處理4 h時(shí),對(duì)植物乳桿菌細(xì)胞膜有一定的破壞,但是破壞程度較小;經(jīng)質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的環(huán)丙沙星處理4 h后的植物乳桿菌(圖2C)在觀察視野里幾乎一半呈現(xiàn)紅色熒光,而另一半呈現(xiàn)綠色熒光,說明0.5 μg/mL的環(huán)丙沙星處理4 h時(shí),對(duì)植物乳桿菌細(xì)胞膜的破壞程度較大;而經(jīng)2.0 μg/mL的環(huán)丙沙星處理4 h后的植物乳桿菌(圖2D)在觀察視野里大部分表現(xiàn)為紅色熒光,而僅有少部分表現(xiàn)為綠色熒光,說明2.0 μg/mL的環(huán)丙沙星處理4 h時(shí)對(duì)菌體細(xì)胞膜的完整性影響程度較其它濃度而言更為嚴(yán)重,即菌體細(xì)胞膜在2.0 μg/mL的環(huán)丙沙星處理4 h時(shí)受到了程度比較大的破壞。這一結(jié)果與脅迫處理后菌體的存活率結(jié)果基本一致。環(huán)丙沙星的殺菌機(jī)理之一就是能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞膜,使細(xì)胞內(nèi)容物流失,因此,不論細(xì)菌處于增殖期還是靜止期,都能迅速降低細(xì)菌活力[30]。所以隨著環(huán)丙沙星濃度的增加,植物乳桿菌的細(xì)胞膜完整性受到的破壞程度隨之增大。

圖2 環(huán)丙沙星脅迫處理對(duì)植物乳桿菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig.2 Effects of ciprofloxacin stress treatment on cell membrane integrity of Lactobacillus plantarum注:在EVOS FL Auto 2成像系統(tǒng)上使用彩色照相機(jī)和10×物鏡采集圖像;A表示未經(jīng)環(huán)丙沙星處理;B表示經(jīng)質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL的環(huán)丙沙星處理;C表示經(jīng)質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的環(huán)丙沙星處理;D表示經(jīng)質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL的環(huán)丙沙星處理。

2.3 環(huán)丙沙星脅迫對(duì)植物乳桿菌細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響

不同濃度環(huán)丙沙星脅迫處理4 h時(shí)對(duì)植物乳桿菌細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響結(jié)果如圖3所示。膜蛋白的運(yùn)動(dòng)方式主要分為側(cè)向及旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng),本試驗(yàn)以嵌二萘為熒光探針,根據(jù)嵌二萘單體和激發(fā)態(tài)二聚體的熒光強(qiáng)度的比值來測(cè)定細(xì)胞膜的側(cè)向擴(kuò)散速率。由圖3可以看出,當(dāng)環(huán)丙沙星質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL時(shí),菌體細(xì)胞側(cè)向擴(kuò)散速率極顯著降低(P<0.01),與對(duì)照組相比降低了39.93%，細(xì)胞膜流動(dòng)性極顯著性降低;而0.1、0.5 μg/mL兩組的細(xì)胞膜側(cè)向擴(kuò)散速率與對(duì)照組相比,下降不顯著(P>0.05),表明細(xì)胞膜流動(dòng)性下降不顯著。由于環(huán)丙沙星脅迫處理植物乳桿菌時(shí),菌體會(huì)改變細(xì)菌細(xì)胞膜流動(dòng)性來調(diào)節(jié)膜脂質(zhì)的組成,從而控制膜的穩(wěn)態(tài)[31-32]。Bessa等[33]研究發(fā)現(xiàn),亞抑制濃度的抗生素的存在不會(huì)顯著改變金黃色葡萄球菌的膜流動(dòng)性,但會(huì)略微影響大腸桿菌的膜流動(dòng)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,環(huán)丙沙星能夠顯著降低植物乳桿菌細(xì)胞膜流動(dòng)性,環(huán)丙沙星作為環(huán)境應(yīng)激物,誘導(dǎo)膜流動(dòng)性發(fā)生變化。細(xì)胞膜的流動(dòng)性對(duì)于細(xì)胞膜功能的正常行使是至關(guān)重要的,膜流動(dòng)性的改變將會(huì)引起細(xì)胞膜功能的改變,例如細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞免疫、細(xì)胞分化與信息轉(zhuǎn)導(dǎo)等。膜流動(dòng)性下降會(huì)引起黏度增加,導(dǎo)致運(yùn)輸功能下降,嚴(yán)重者可破壞膜結(jié)構(gòu),增大膜通透性,使內(nèi)容物大量排出,引起細(xì)胞死亡。細(xì)胞膜上的酶活性與流動(dòng)性也有很大關(guān)系,在一定范圍內(nèi),膜的流動(dòng)性降低不利于酶分子側(cè)向擴(kuò)散和旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng),使酶活性降低[34]。所以,研究環(huán)丙沙星對(duì)植物乳桿菌細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響,有利于了解環(huán)丙沙星對(duì)乳桿菌細(xì)胞膜功能或細(xì)胞功能的影響。

圖3 環(huán)丙沙星脅迫處理對(duì)植物乳桿菌細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響Fig.3 Effects of ciprofloxacin stress treatment on cell membrane fluidity of Lactobacillus plantarum注:與對(duì)照組相比較,*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.4 環(huán)丙沙星脅迫下植物乳桿菌菌體形態(tài)的場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡結(jié)果

將處理好的樣品放置于SU-8010場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下觀察(工作電壓10 kV),放大倍數(shù)為30000×,選取有代表性的視野,觀察結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出,不同濃度的環(huán)丙沙星脅迫下菌體形態(tài)差異明顯。未經(jīng)環(huán)丙沙星處理過的植物乳桿菌外觀呈典型的桿狀直線型,兩端以圓弧形收尾,相互交替排列,菌體飽滿無缺陷。經(jīng)質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL環(huán)丙沙星處理4 h后,菌體出現(xiàn)凹陷、干扁、塌縮的現(xiàn)象,排列雜亂,少數(shù)菌體細(xì)胞表面出現(xiàn)破裂,細(xì)胞內(nèi)容物泄露。經(jīng)0.5 μg/mL環(huán)丙沙星處理4 h后,菌體長度縮短,排列無序,細(xì)胞表面破裂的菌體數(shù)量增加。經(jīng)2.0 μg/mL環(huán)丙沙星處理4 h后,植物乳桿菌細(xì)胞形態(tài)受損程度最大。菌體長度的縮短程度最大,大部分菌體表面破裂,菌體內(nèi)容物外泄。試驗(yàn)結(jié)果表明,環(huán)丙沙星脅迫明顯改變了植物乳桿菌的菌體形態(tài),嚴(yán)重時(shí)可造成細(xì)胞質(zhì)外泄,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡;且菌體改變和受損的程度與環(huán)丙沙星濃度呈正相關(guān)。

表1 環(huán)丙沙星脅迫對(duì)植物乳桿菌糖代謝關(guān)鍵酶活力的影響(U/mg prot)Table 1 Effect of ciprofloxacin stress on key enzyme activity of glucose metabolism of Lactobacillus plantarum(U/mg prot)

注:與對(duì)照組相比較,*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

圖4 環(huán)丙沙星脅迫處理下植物乳桿菌的掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron micrograph ofLactobacillus plantarum treated with ciprofloxacin stress注:放大倍數(shù):30000×;圖A表示未經(jīng)環(huán)丙沙星處理;圖B表示經(jīng)質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL 環(huán)丙沙星處理4 h;圖C表示經(jīng)質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL環(huán)丙沙星處理4 h;圖D表示經(jīng)質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL環(huán)丙沙星處理4 h。

環(huán)丙沙星通過抑制細(xì)菌DNA的合成發(fā)揮其抑菌作用。環(huán)丙沙星作用下,菌體內(nèi)形成旋轉(zhuǎn)酶-DNA-環(huán)丙沙星復(fù)合物,菌體復(fù)制系統(tǒng)受到抑制,此時(shí)細(xì)胞會(huì)觸發(fā)應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制,也被稱為SOS反應(yīng)[35]。Ysern等[36]已經(jīng)指出,一些抗生素,例如氟喹諾酮類,可作為SOS反應(yīng)的有效誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)細(xì)菌中的SOS反應(yīng)增加菌體突變的頻率,而菌體發(fā)生突變將有利于其生存。另外,環(huán)丙沙星誘導(dǎo)的SOS反應(yīng)可能造成細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的滲漏。有研究表明,即使環(huán)丙沙星作用的主要目標(biāo)位于不影響細(xì)胞壁合成的位點(diǎn),也會(huì)破壞細(xì)菌表面、改變菌體形態(tài)[37]。Elliott等[38]研究發(fā)現(xiàn),大腸桿菌暴露于濃度為1～50 μg/mL的環(huán)丙沙星或諾氟沙星后,細(xì)胞壁在30 min內(nèi)發(fā)生絲狀化,隨后細(xì)菌的細(xì)胞壁發(fā)生破裂。借助場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡真實(shí)形象地表達(dá)植物乳桿菌在環(huán)丙沙星脅迫下菌體形態(tài)的變化,能夠?yàn)榄h(huán)丙沙星脅迫下植物乳桿菌的應(yīng)激機(jī)理的研究提供一定的依據(jù)。

2.5 環(huán)丙沙星脅迫對(duì)植物乳桿菌糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響

氟喹諾酮類抗生素脅迫會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生不利影響,了解菌體通過改變葡萄糖代謝酶活性對(duì)環(huán)丙沙星脅迫條件作出的應(yīng)激反應(yīng)是有必要的。由表1可以看出,就己糖激酶而言,2.0 μg/mL環(huán)丙沙星處理4 h后,酶活極顯著下降(P<0.01),為(3.29±0.63) U,而0.1、0.5 μg/mL兩組處理后,其酶活與對(duì)照組相比下降程度不顯著(P>0.05),這一結(jié)果表明己糖激酶不是環(huán)丙沙星脅迫引起菌體應(yīng)激的主要代謝酶。

與對(duì)照組相比,植物乳桿菌在0.1、0.5、2.0 μg/mL的環(huán)丙沙星脅迫4 h后,丙酮酸激酶活力均極顯著下降P<0.01),表明環(huán)丙沙星脅迫4 h后對(duì)丙酮酸激酶活力影響效果極顯著(P<0.01),且酶活力下降程度與環(huán)丙沙星濃度呈正相關(guān),活力分別下降了24.78%、36.56%、48.46%,這一結(jié)果說明丙酮酸激酶是環(huán)丙沙星脅迫下菌體產(chǎn)生應(yīng)激的關(guān)鍵代謝酶。己糖激酶和丙酮酸激酶作為菌體糖酵解中催化不可逆反應(yīng)的關(guān)鍵酶,其活性受細(xì)胞能荷調(diào)節(jié)。環(huán)丙沙星脅迫下會(huì)使菌體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),可能使得胞內(nèi)能荷升高,從而抑制己糖激酶和丙酮酸激酶的活性[39];環(huán)丙沙星脅迫可能造成的胞內(nèi)丙酮酸激酶磷酸化也可能是丙酮酸激酶活性下降的另一種原因[40]。

對(duì)照組中乳酸脫氫酶酶活約為(0.069±0.002) U,在0.1 μg/mL環(huán)丙沙星處理4 h后,酶活下降不顯著(P>0.05),說明低劑量組環(huán)丙沙星對(duì)菌體乳酸脫氫酶影響不大,該酶在低劑量環(huán)丙沙星脅迫下處于穩(wěn)定狀態(tài);在2.0 μg/mL環(huán)丙沙星處理4 h后,酶活下降極顯著(P<0.01),降低了約53.62%,說明高劑量組環(huán)丙沙星對(duì)植物乳桿菌乳糖代謝具有抑制作用;而加入0.5 μg/mL環(huán)丙沙星脅迫4 h后,乳酸脫氫酶活力反而增加,酶活為(0.081±0.006) U/mg prot(P<0.01),說明中劑量組環(huán)丙沙星會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生相應(yīng)的脅迫應(yīng)激。進(jìn)一步用0.5 μg/mL環(huán)丙沙星反復(fù)脅迫菌體,菌體乳酸脫氫酶的酶活為(0.126±0.004) U/mg prot(表2),影響極顯著(P<0.01)。在環(huán)丙沙星脅迫下,菌體可能通過調(diào)節(jié)自身中mRNA降解、基因表達(dá)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝水平來影響參與葡萄糖代謝的酶[41-42],誘導(dǎo)植物乳桿菌乳酸脫氫酶酶活力增大。

表2 0.5 μg/mL環(huán)丙沙星反復(fù)脅迫對(duì)植物乳桿菌乳酸脫氫酶活力的影響(U/mg prot)Table 2 Effects of repeated stress of 0.5 μg/mL ciprofloxacin on the activity of lactate dehydrogenase in Lactobacillus plantarum(U/mg prot)

注:與未經(jīng)反復(fù)脅迫組相比較,*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

環(huán)丙沙星脅迫下菌體糖代謝關(guān)鍵酶活力下降,使得菌體對(duì)葡萄糖利用率降低,造成菌體有氧代謝受到抑制,進(jìn)而改變糖代謝和能量通量,同時(shí)改變菌體的生長速率,使碳源代謝適應(yīng)新環(huán)境[43];從另一個(gè)角度而言,環(huán)丙沙星脅迫造成細(xì)胞膜完整性受損,可能造成位于胞液中的己糖激酶、丙酮酸激酶及乳酸脫氫酶泄露,導(dǎo)致其酶活力發(fā)生變化[44]。上述結(jié)果為深入研究環(huán)丙沙星脅迫下菌體糖代謝關(guān)鍵酶的變化情況提供了重要參考,也為乳酸菌在環(huán)丙沙星脅迫下的代謝機(jī)制的研究提供了思路。

3 結(jié)論

氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星會(huì)嚴(yán)重破壞菌體生長,隨著其質(zhì)量濃度增大,菌體存活率依次降低,經(jīng)質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL的環(huán)丙沙星脅迫后乳桿菌存活率僅為40.21%,活菌數(shù)量劇減將使菌體群體反應(yīng)效應(yīng)減弱,直接影響菌體定植以及發(fā)揮相應(yīng)的益生功能;環(huán)丙沙星脅迫可改變植物乳桿菌細(xì)胞結(jié)構(gòu),破壞細(xì)胞膜完整性,降低細(xì)胞膜流動(dòng)性,阻滯細(xì)胞代謝;通過測(cè)定不同質(zhì)量濃度環(huán)丙沙星脅迫后菌體葡萄糖代謝關(guān)鍵酶活,發(fā)現(xiàn)菌體主能量代謝路徑中的己糖激酶、丙酮酸激酶均出現(xiàn)不同程度的下降,而只有乳酸脫氫酶在質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的環(huán)丙沙星脅迫下酶活力升高,反復(fù)用質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的環(huán)丙沙星脅迫植物乳桿菌后,發(fā)現(xiàn)菌體乳酸脫氫酶酶活不降反升,究其原因?yàn)橹参锶闂U菌經(jīng)該濃度環(huán)丙沙星主動(dòng)脅迫后,為增加能量代謝維持菌體存活,會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激,通過自身調(diào)節(jié),誘導(dǎo)植物乳桿菌乳酸脫氫酶酶活力增大以保護(hù)菌體。本研究選取的氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星濃度涵蓋了我國規(guī)定的環(huán)丙沙星的ADI可能到達(dá)人體結(jié)腸的量,同時(shí)實(shí)驗(yàn)菌株為來源于人腸道的植物乳桿菌,因此,本文研究結(jié)果有助于腸道益生菌制劑的研發(fā),在緩解抗生素脅迫引起的腸道應(yīng)激方面具有實(shí)踐及應(yīng)用價(jià)值。