,2,*,2,*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350028;2.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心,福建福州 350028)

胃腸道是人消化及免疫的重要器官,富集著豐富的微生物群落[1]。這些胃腸道益生菌群在食物消化和營(yíng)養(yǎng)吸收、改善腸道微生態(tài)平衡,免疫調(diào)節(jié)促進(jìn)機(jī)體健康等方面都具有重要的作用[2]。胃腸道益生菌主要分為3大類:雙歧桿菌類、乳酸桿菌類和革蘭氏陽(yáng)性球菌。其中保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌被認(rèn)為是3種重要的益生菌[3-4]。保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)屬于乳酸桿菌屬,在牛奶發(fā)酵中具有重要的應(yīng)用,是乳酸菌中產(chǎn)酸量最高的菌種[5],研究發(fā)現(xiàn)保加利亞人長(zhǎng)壽的秘訣在于其長(zhǎng)期飲用發(fā)酵乳[6];青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)多見(jiàn)于嬰幼兒的腸道內(nèi),對(duì)嬰兒的發(fā)育具有重要作用,不僅能夠調(diào)整腸道菌群,防止便秘,還能降低結(jié)腸癌的發(fā)病率等[7-8];嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)具有改善腸道功能，提高機(jī)體免疫能力，緩解乳糖不耐癥等多種生理功效[9-10]。這3種益生菌可定植到人體腸道內(nèi),進(jìn)一步抑制有害腸道微生物的生長(zhǎng)[11-12]。

許多食用菌中的提取物對(duì)改善和調(diào)節(jié)腸道微生物均具有一定的作用。富硒猴頭菇凍干粉可顯著增多小鼠腸道中雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量,具有調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群的作用[13];香菇的酶解物可改善小鼠腸道菌群環(huán)境和調(diào)節(jié)腸道功能[14];靈芝多糖可以通過(guò)改善調(diào)節(jié)小鼠腸道的微生物群落結(jié)構(gòu)以及維持腸屏障來(lái)降低小鼠的肥胖率及其炎癥[15];金針菇、香菇、黑木耳、平菇、雙孢菇、杏鮑菇6種食用菌子實(shí)體水提物對(duì)糞便懸液中腸道菌群的菌群種類和菌群結(jié)構(gòu)具有一定的影響[16]。猴頭菇(Hericiumerinaceus(Bull.)Pers.)作為一種大型食藥用菌,屬于擔(dān)子菌亞門、擔(dān)子菌綱、多孔菌目、齒菌科、猴頭屬[17]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,猴頭菇性平、味甘、利五臟、助消化;具有健胃、補(bǔ)虛、抗癌、益腎精之功效[18]。大量研究結(jié)果顯示,猴頭菇提取物營(yíng)養(yǎng)豐富,化學(xué)成分眾多,其中多糖被認(rèn)為是猴頭菇具有多種藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[19-21]。猴頭菇多糖有抗氧化和清除DPPH自由基的功能,較于其他杏鮑菇,平菇等真菌多糖具有更顯著的效果[22]。猴頭菇子實(shí)體對(duì)于胃、十二指腸潰瘍等具有療效,而猴頭菇子實(shí)體小分子提取物能顯著地抑制幽門螺桿菌的生長(zhǎng)[23]。

但關(guān)于猴頭菇多糖對(duì)于上述3種胃腸道益生菌的直接生長(zhǎng)影響研究較少。因此,本研究擬在培養(yǎng)基中添加不同含量的猴頭菇多糖,檢測(cè)這3種胃腸道益生菌的生長(zhǎng)情況,同時(shí)通過(guò)模擬人體胃腸道環(huán)境,探究猴頭菇多糖對(duì)3種益生菌在胃液和腸液中耐受力的影響,為猴頭菇功能食品的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菇多糖 純度為64%,福建省尤溪縣天茸生物技術(shù)有限公司;胰蛋白酶250 NFU/mg、胃蛋白酶≥250 U/mg、L-鹽酸半胱氨酸 北京索萊寶科技有限公司;保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌 北京川秀科技有限公司,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室自行分離獲得純菌株;青春雙歧桿菌菌株 上海滬崢生物科技有限公司,編號(hào)為:ATCC 15703;TPY培養(yǎng)基(青春雙歧桿菌) 青島海博生物科技有限公司。

UV-2600紫外分光光度計(jì) 島津儀器(蘇州)有限公司;明澈TM-D2超凈純水系統(tǒng) 德國(guó)Thermo Scientific;SPX-250生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(保加利亞乳桿菌):蒸餾水1000 mL,牛肉膏10.0 g,蛋白胨5.0 g,NaCl 5.0 g,葡萄糖5.0 g,醋酸鈉3.0 g,L-鹽酸半胱氨酸0.5 g,酵母粉3.0 g,調(diào)節(jié)pH至6.8左右。

TYC培養(yǎng)基(嗜熱鏈球菌):蒸餾水1000 mL,蔗糖5.0 g,胰蛋白胨15.0 g,亞硫酸鈉0.1 g,乙酸鈉2.0 g,酵母浸粉5.0 g,L-鹽酸半胱氨酸0.2 g,NaCl 1.0 g,NaHCO32.0 g,Na2HPO42.0 g,調(diào)節(jié)pH至7.3左右。

1.2.2 菌種活化 從保存的保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌菌種制劑中分別取一環(huán)接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基、TPY培養(yǎng)基和TYC培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后,取0.1 mL接種于相應(yīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,傳代兩次后得到相應(yīng)活化的菌種。其中青春雙歧桿菌為厭氧型微生物,故將其置于裝有厭氧產(chǎn)氣袋的不透氣樂(lè)扣箱培養(yǎng)。

1.2.3 菌種稀釋度的確定 取3%已活化的液體菌種接種到裝有20 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的18 cm×180 cm試管,待達(dá)到菌種培養(yǎng)穩(wěn)定期時(shí)(約10～18 h),取1 mL菌液稀釋,稀釋梯度為10-1～10-8,分別取0.1 mL的菌液于相應(yīng)平板中涂布。經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)數(shù),記錄菌落數(shù)在30～300 cfu的平板和相應(yīng)的稀釋倍數(shù),為正式平板計(jì)數(shù)確定合適的三個(gè)稀釋度。

1.2.4 體外胃腸模擬液的制備 按2015版《中國(guó)藥典》配制體外胃模擬液:以磷酸緩沖鹽溶液(PBS,0.1 mol/L,pH=7.4)替換配制試驗(yàn)培養(yǎng)基中的水,用37%的鹽酸溶液調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基pH至3.0。于高壓滅菌鍋(121 ℃,15 min)中滅菌,用無(wú)菌水將一定量經(jīng)紫外滅過(guò)菌的胃蛋白酶溶解,添加到冷卻至室溫的培養(yǎng)基中,配制成含0.5%胃蛋白酶的試驗(yàn)培養(yǎng)基,體外模擬胃環(huán)境。

按2015版《中國(guó)藥典》配制體外腸模擬液:以PBS緩沖液替換配制試驗(yàn)培養(yǎng)基中的水,用37%的鹽酸溶液調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基pH至7.0。于高壓滅菌鍋(121 ℃,15 min)中滅菌,用無(wú)菌水將一定量經(jīng)紫外滅過(guò)菌的胰蛋白酶溶解,添加到冷卻至室溫的培養(yǎng)基中,配制成含1%胰蛋白酶的試驗(yàn)培養(yǎng)基,體外模擬腸環(huán)境。

1.2.5 三種益生菌生長(zhǎng)曲線的檢測(cè) 取0.1 mL活化的液體菌種,接種于39個(gè)裝有20 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基大試管中,編號(hào)分別為0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h,每個(gè)編號(hào)設(shè)置3個(gè)試管,于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后測(cè)定每個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的菌液在600 nm處的吸光值,取三個(gè)試管吸光值的平均值繪制生長(zhǎng)曲線。測(cè)得的保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定期的時(shí)間分別為T1、T2、T3。

1.2.6 猴頭菇多糖對(duì)三種益生菌體外生長(zhǎng)的影響試驗(yàn) 分別取0.6 mL的保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌菌液接種至20 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(CK)與分別添加0.3%、0.5%、0.7%猴頭菇多糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。再將保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌的上述培養(yǎng)基分別于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)T1、T2、T3時(shí)間后,各取1 mL菌液根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)的稀釋,每個(gè)稀釋液各取0.1 mL,涂布于選擇性培養(yǎng)基平板中,于37 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)算菌落數(shù)。每組試驗(yàn)重復(fù)三次。

表1 不同稀釋度的三種菌在猴頭菇多糖平板上的菌落數(shù)情況Table 1 Colony number of three kinds of bacteria with different dilutions on Hericium erinaceus polysaccharide plate

注:-表示數(shù)量較多,無(wú)法計(jì)算。

1.2.7 添加猴頭菇多糖對(duì)三種益生菌在模擬胃液、腸液培養(yǎng)基中的耐受性試驗(yàn) 分別于模擬胃液試驗(yàn)培養(yǎng)基和模擬腸液試驗(yàn)培養(yǎng)基中加入7%猴頭菇多糖提取物代替葡萄糖,再分別以不含猴頭菇多糖胃液和腸液試驗(yàn)培養(yǎng)基為對(duì)照組(CK),分別接種0.6 mL三種益生菌活化菌液,混勻后立即取1 mL稀釋,于平板中涂布,經(jīng)37 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù),為0 h的菌數(shù)。將試驗(yàn)培養(yǎng)基放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 h后取出試驗(yàn)培養(yǎng)基,取1 mL稀釋,于平板中涂布,經(jīng)37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，其為3 h平板菌落數(shù),每組試驗(yàn)重復(fù)三次。然后分別計(jì)算存活率,存活率為3 h后的菌落總數(shù)與0 h的菌落總數(shù)的比值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0,用Originpro 8.0、Excel 2010進(jìn)行做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種益生菌生長(zhǎng)曲線

保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)曲線如圖1所示,三種乳酸菌在0～4 h都處在調(diào)整期。4 h以后,三種乳酸菌都漸漸步入指數(shù)期。保加利亞乳桿菌在18 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期,青春雙歧桿菌在14 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期,而嗜熱鏈球菌在10 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。因此,在研究猴頭菇多糖對(duì)乳酸菌體外生長(zhǎng)影響試驗(yàn)與模擬腸胃試驗(yàn)中,三種乳酸菌的菌種最佳培養(yǎng)時(shí)間分別為:18 h(保加利亞乳桿菌)、14 h(青春雙歧桿菌)、10 h(嗜熱鏈球菌)。

圖1 三種乳酸菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of three kinds of lactic acid bacteria

2.2 猴頭菇多糖對(duì)三種益生菌體外生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在不同多糖添加量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后,取樣進(jìn)行平板計(jì)算,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和圖2。保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌分別以10-6、10-5和10-5為有效稀釋度,在培養(yǎng)基中添加0.3%的猴頭菇多糖,三種益生菌的生長(zhǎng)量均明顯增加。當(dāng)培養(yǎng)基中猴頭菇多糖含量由0.3%增加至0.7%時(shí),保加利亞乳桿菌和青春雙歧桿菌的生長(zhǎng)量均增長(zhǎng)明顯,達(dá)到顯著性差異(P<0.05)。而嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)量隨著猴頭菇多糖含量逐漸增加時(shí)增速放緩,0.5%與0.7%的猴頭菇多糖添加量組中,嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)量沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。與山藥多糖(12.5%濃度,雙歧桿菌數(shù)量增加最顯著)[24]和白術(shù)多糖(2.0%濃度,雙歧桿菌數(shù)量增加最顯著)[25]相比,只需更低的猴頭菇多糖量即可促進(jìn)雙歧桿菌的數(shù)量增加,顯示出猴頭菇多糖對(duì)三種益生菌的促進(jìn)增長(zhǎng)作用更強(qiáng)。

圖2 猴頭菇多糖含量對(duì)三種益生菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of polysaccharide fromHericium erinaceus on the growth of three probiotics注:對(duì)于同一種益生菌，小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表2 不同稀釋度的三種菌在猴頭菇多糖的模擬胃液平板上菌落數(shù)情況Table 2 Colony number of three kinds of bacteria with different dilutions on simulated gastric fluid plate with Hericium erinaceus polysaccharides

注:-表示數(shù)量較多,無(wú)法計(jì)算;同一菌種不同處理的菌落總數(shù)比較,用a、b、c和d表示顯著性差異(P<0.05)。

表3 不同稀釋度三種乳酸菌在猴頭菇多糖的模擬腸液平板上菌落數(shù)情況Table 3 Colony number of three kinds of bacteria with different dilutions on simulated intestinal juice plate with Hericium erinaceus polysaccharides

注:-表示數(shù)量較多,無(wú)法計(jì)算;同一菌種不同處理的菌落總數(shù)比較,用a、b、c和d表示顯著性差異(P<0.05)。

2.3 添加猴頭菇多糖對(duì)三種益生菌在模擬胃液中的耐受性影響

分別用含7%猴頭菇多糖、pH為3.0的模擬胃液培養(yǎng)基對(duì)三種菌培養(yǎng)3 h后,取樣進(jìn)行平板計(jì)算(表2),結(jié)果顯示:三種菌的有效稀釋度均為10-3,未添加猴頭菇多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h后,保加利亞乳桿菌存活率為64.32%;添加7%猴頭菇多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h后,保加利亞乳桿菌的存活率為71.83%,存活率提升了7.51%。而青春雙歧桿菌的存活率由原來(lái)的67.52%提升到69.43%,提升了1.91%;嗜熱鏈球菌的存活率由原來(lái)的67.82%提升到68.93%,提升了1.11%。因此,猴頭菇多糖能夠顯著(P<0.05)增強(qiáng)保加利亞乳桿菌對(duì)胃液的耐受性,而對(duì)青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的改善作用不是很顯著(P>0.05)。

2.4 添加猴頭菇多糖對(duì)三種益生菌在模擬腸液中的耐受性影響

分別用含7%猴頭菇多糖、pH為7的模擬腸液的培養(yǎng)基對(duì)三種菌進(jìn)行培養(yǎng)3 h后,取樣進(jìn)行平板計(jì)算(表3),結(jié)果顯示:三種菌的有效稀釋度均為10-3,未添加猴頭菇多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h后,再培養(yǎng)后保加利亞乳桿菌存活率為77.52%;添加猴頭菇多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h后,再培養(yǎng)后保加利亞乳桿菌的存活率為81.32%,存活率提升了3.80%。而青春雙歧桿菌的存活率由原來(lái)的72.61%提升到73.46%,提升了0.85%;嗜熱鏈球菌的存活率由原來(lái)的67.24%提升到78.62%,提升了11.38%。因此,猴頭菇多糖能夠顯著增強(qiáng)嗜熱鏈球菌(P<0.01)和保加利亞乳桿菌(P<0.05)對(duì)腸液的耐受性,而對(duì)青春雙歧桿菌的改善作用不是很明顯(P>0.05)。

3 討論

猴頭菇養(yǎng)胃功效作用的腸道微生物的種類仍未明確[7,12]。本研究通過(guò)在乳酸菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的猴頭菇多糖,發(fā)現(xiàn)猴頭菇多糖能夠促進(jìn)保加利亞乳桿菌、青春雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌胃腸益生菌的生長(zhǎng)。其中保加利亞乳桿菌與青春雙歧桿菌的生長(zhǎng)量隨著猴頭菇多糖添加量的增多而增加。而嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)量在猴頭菇多糖含量為0.5%時(shí)增速放緩。通過(guò)模擬人體胃腸道環(huán)境,發(fā)現(xiàn)猴頭菇多糖能夠顯著增強(qiáng)保加利亞乳桿菌對(duì)胃液和腸液的耐受性,顯著增強(qiáng)青春雙歧桿菌對(duì)腸液的耐受性,增強(qiáng)嗜熱鏈球菌對(duì)腸液的耐受性。

多糖是食用菌重要的生物活性物質(zhì)之一,可作為胃腸道益生菌的能源物質(zhì),還可促進(jìn)這些益生菌對(duì)腸道細(xì)胞的粘附,從而保持胃腸道正常的黏膜免疫系統(tǒng)[18,20,26-27]。猴頭菇養(yǎng)胃功效的作用機(jī)制雖未明確,從本研究的結(jié)果可以推斷猴頭菇多糖的作用可能是一方面增強(qiáng)一些腸胃益生菌對(duì)胃液、腸液的耐受力,從而調(diào)節(jié)胃腸內(nèi)的益生菌的菌群結(jié)構(gòu);另一方面,猴頭菇多糖能促進(jìn)胃腸內(nèi)原有益生菌的生長(zhǎng),促進(jìn)胃腸內(nèi)部的益生菌數(shù)量,從而起到改善調(diào)節(jié)胃腸的作用。本研究為猴頭菇改善胃腸道的功能性食品的開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。當(dāng)然,本文對(duì)于猴頭菇多糖具體是如何調(diào)節(jié)腸胃內(nèi)微生物的生長(zhǎng)的機(jī)理尚不清楚,需要進(jìn)一步的深入研究。