李玉玲 毛 尊 鞏玉森

乳腺癌(breast cancer ，BC)是女性最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為較黑色素瘤及腎惡性腫瘤具有較低的免疫原性[1]。實(shí)際上，乳腺癌是一種多基因參與的高度異質(zhì)性腫瘤。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌具有免疫作用，其中ER陰性、高度增殖性乳腺癌具有較高免疫原性[2,3]。近年來(lái)，癌癥免疫治療領(lǐng)域取得巨大進(jìn)展，特別是免疫檢查點(diǎn)抑制劑的開(kāi)發(fā)，如ipilumumab、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(cytotoxic lymphocyte- associated antigen-4 ，CTLA-4)和程序性死亡受體-1(programmed cell death 1，PD-1)/程序性死亡配體-1(programmed death ligand 1，PD-L1)軸抑制劑[4]。其中PD-1/PD-L1軸被認(rèn)為是乳腺癌免疫治療中最有希望的靶點(diǎn)。PD-1是由多種免疫細(xì)胞(如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等)表達(dá)的細(xì)胞表面膜蛋白，與其配體PD-L1和(或)PD-L2結(jié)合后，抑制淋巴細(xì)胞激活，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活化，從而抑制免疫應(yīng)答[5～7]。在癌癥中是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的共同機(jī)制。PD-L1 在多種腫瘤組織微環(huán)境內(nèi)上調(diào)，能夠使癌癥相關(guān)免疫細(xì)胞發(fā)生凋亡，減弱其免疫原性，參與癌癥的免疫逃逸過(guò)程。PD-1/PD-L1抑制劑的臨床試驗(yàn)顯示出非常有希望的效果和持久的反應(yīng)性，特別是在黑色素瘤、肺癌和膀胱癌中[4,8]。此外，PD-L1表達(dá)與治療客觀反應(yīng)之間具有相關(guān)性[8]。至于PD-L1作為免疫治療預(yù)測(cè)標(biāo)志物的研究在乳腺癌中仍然較少，因此探索PD-L1在乳腺癌組織的表達(dá)具有一定的必要性。本研究采用免疫組化SP法判斷PD-L1在乳腺癌組織微陣列(TMA)上的表達(dá)，并分析PD-L1表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)及生存預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

1.臨床資料:收集2010年4月～2016年5月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺癌石蠟標(biāo)本217例，選擇腫瘤組織的核心區(qū)域構(gòu)建TMA。217例患者的平均年齡為50.0±10.7歲，范圍為26～80歲；腫瘤最大直徑0.6～7.2cm，平均直徑為2.79±1.40cm；腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移93例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移124例；根據(jù)《WHO乳腺腫瘤分類》內(nèi)改良Scarff-Bloom-Richardson分級(jí)系統(tǒng)，判斷腫瘤組織分化程度，SBR 1級(jí)9例，2級(jí)148例，3級(jí)60例；根據(jù)ER、PR、HER-2和Ki67的表達(dá)比率，將乳腺癌分為4組分子亞型，Luminal A 型13例，Luminal B型 81例，HER-2過(guò)表達(dá)型60例，TNBC型63例；根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)及美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)乳腺癌TNM分期方法，Ⅰ+Ⅱ期183例， Ⅲ+Ⅳ期34例。

2.TMA的建立:TMA使用最具代表性的區(qū)域構(gòu)建，其中單個(gè)病例具有一個(gè)重復(fù)。所有腫瘤組織核心區(qū)域的選擇均由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生對(duì)組織切片進(jìn)行評(píng)估后決定。兩名病理醫(yī)生在同一病例中核心區(qū)域選擇的差異通過(guò)聯(lián)合分析解決。從每個(gè)乳腺癌病例石蠟切片形態(tài)學(xué)上具有代表性的區(qū)域(腫瘤內(nèi)核心)沖壓出直徑0.6mm的組織圓柱體，并使用半自動(dòng)化組織塊將其帶入一個(gè)空白石蠟(2.5～3.0cm)中。

3.免疫組化:采用免疫組化SP法進(jìn)行染色，4μm切片的TMA組織經(jīng)檸檬酸鈉溶液熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)后，過(guò)氧化氫阻止內(nèi)源性過(guò)氧化物酶表達(dá)，超級(jí)封閉液減少一抗非特異性結(jié)合，滴加預(yù)稀釋的PD-L1 (E1L3N)單克隆抗體(兔抗人，1∶400，美國(guó)CST公司)37℃溫箱孵育1h。滴加酶標(biāo)二抗聚合物37℃溫箱孵育20min。使用標(biāo)準(zhǔn)DAB技術(shù)進(jìn)行免疫染色。用蘇木精溶液進(jìn)行復(fù)染。PD-L1的結(jié)果判讀:①部分或完整細(xì)胞膜染色(≥1+)的腫瘤細(xì)胞占全部腫瘤細(xì)胞<1%，為PD-L1陰性；②部分或完整細(xì)胞膜染色(≥1+)的腫瘤細(xì)胞占全部腫瘤細(xì)胞≥1%，為PD-L1陽(yáng)性。Ki67以20%為截點(diǎn)，判斷表達(dá)高低。

4.隨訪:217例乳腺癌患者中有209例具有完整臨床隨訪信息，隨訪時(shí)間為1～100個(gè)月，中位隨訪時(shí)間63個(gè)月，其中死亡24例，轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)44例，生存(截尾數(shù)據(jù))8例。總體存活(overall survival,OS)：是第1次確診開(kāi)始到任何原因引起患者死亡的時(shí)間(失訪為最后一次隨訪時(shí)間；仍然存活為隨訪結(jié)束時(shí)間)。無(wú)病存活(disease free survival,DFS)：是第1次確診到患者發(fā)生復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的時(shí)間(失訪為最后一次隨訪時(shí)間；仍然存活為隨訪結(jié)束時(shí)間)。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)分析PD-L1表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。使用Kaplan-Meier方法和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)來(lái)計(jì)算OS和DFS比率并比較存活曲線之間的差異。使用單因子COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型識(shí)別與乳腺癌OS和DFS顯著相關(guān)的因子，多變量COX模型評(píng)估了PD-L1表達(dá)與其他因子之間的雙向相互作用,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.乳腺癌臨床病理特征:關(guān)于腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及血管侵犯的結(jié)果顯示分別有42.9%(93/217)、17.1%(37/217)和21.2%(46/217)的陽(yáng)性病例。SBR分類結(jié)果顯示只有4.2%(9/217)為Ⅰ級(jí)，95.8%(208/217)為Ⅱ級(jí)及Ⅲ級(jí)[分別為68.2%(148/217)和27.6%(60/217)]?；诿庖呓M織化學(xué)染色，ER、PR和HER-2陽(yáng)性率分別為30.4%(66/217)、37.3%(81/217)和42.9%(93/217)。同時(shí)評(píng)估了Ki67的表達(dá)情況，71.0%(154/217)患者Ki67高表達(dá)，29.0%(63/217)低表達(dá)。分子分型結(jié)果顯示Luminal B型是最常見(jiàn)，占總體的37.3%(81/217)，其次是TNBC型為29.0%(63/217,表1)。

2.PD-L1表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系:PD-L1陽(yáng)性表達(dá)主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)(圖1)。217例可評(píng)估原發(fā)性乳腺癌組織構(gòu)成的TMA中，PD-L1陽(yáng)性率為14.7%(32/217)，PD-L1在乳腺癌分子亞型中陽(yáng)性率,以TNBC型最高，為30.2%(19/63)，其次HER-2過(guò)表達(dá)型13.3%(8/60)，Luminal A型 7.7%(1/13)和Luminal B型4.9%(4/81)，且PD-L1表達(dá)與分子分型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達(dá)與患者的年齡、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、血管侵犯及TNM分期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而與腫瘤的直徑、組織分化程度、ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、HER-2狀態(tài)和Ki67高表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 PD-L1與217例乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖1 PD-L1在乳腺癌組織微陣列上的表達(dá)A.PD-L1在胎盤(pán)(陽(yáng)性對(duì)照)中的表達(dá)(SP，×20)；B.PD-L1在乳腺癌弱陽(yáng)性表達(dá)(SP，×20)；C.PD-L1在乳腺癌強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(SP，×40)

3.PD-L1表達(dá)與乳腺癌患者生存的關(guān)系:Kaplan-Meier結(jié)果顯示，PD-L1陽(yáng)性乳腺癌及TNBC患者的OS及DFS時(shí)間長(zhǎng)于PD-L1陰性患者，但Log-Rank檢驗(yàn)結(jié)果表明PD-L1表達(dá)與乳腺癌OS及DFS無(wú)關(guān)(OS:χ2=2.313，P=0.128；DFS:χ2=2.345，P=0.126,圖2),而與TNBC患者更好的OS及DFS相關(guān)(OS:χ2=5.771，P=0.016；DFS:χ2=5.783，P=0.016,圖3)。使用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型單變量分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與乳腺癌及TNBC患者的OS及DFS有關(guān)；ER、PR狀態(tài)與乳腺癌患者OS及DFS有關(guān)，TNM分期與乳腺癌患者DFS有關(guān)，PD-L1與TNBC患者的OS及DFS有關(guān)(P<0.05)，進(jìn)一步進(jìn)行COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多變量分析顯示，PD-L1陽(yáng)性仍然可作為判斷TNBC患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)，PR狀態(tài)是判斷乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)，而淋巴結(jié)在乳腺癌及TNBC患者中均為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)(表2～表5)。

圖2 乳腺癌患者預(yù)后的Kaplan-Meier曲線A.PD-L1陽(yáng)性患者OS(P=0.128);B.PD-L1陽(yáng)性患者的DFS(P=0.126)

圖3 TNBC患者預(yù)后的Kaplan-Meier曲線A.PD-L1陽(yáng)性患者的OS(P=0.016);B.PD-L1陽(yáng)性患者的DFS(P=0.016)

討 論

PD-L1是I型跨膜蛋白，在小鼠和人抗原呈遞細(xì)胞，非造血細(xì)胞和非淋巴器官如心臟、肺、胎盤(pán)和肝臟中組成型表達(dá)，并在多種惡性腫瘤微環(huán)境中上調(diào)，如結(jié)腸癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌[9～12]。PD-L1與PD-1相互作用，導(dǎo)致T細(xì)胞活化和增殖降低，抑制抗細(xì)胞凋亡分子Bcl-xl的表達(dá)和促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，使癌癥相關(guān)免疫細(xì)胞發(fā)生凋亡，減弱其免疫原性，從而抑制免疫應(yīng)答，這種機(jī)制可以使癌細(xì)胞逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視，介導(dǎo)疾病進(jìn)展[5,6]。

表2 乳腺癌OS單因素及多因素COX回歸分析

表3 乳腺癌DFS單因素及多因素COX回歸分析

表4 TNBC OS單因素及多因素COX回歸分析

表5 TNBC DFS單因素及多因素COX回歸分析

本研究中乳腺癌患者PD-L1的陽(yáng)性率為14.7%，在TNBC中，PD-L1表達(dá)上調(diào)，陽(yáng)性率為30.2%。與 Sabatier等[13]對(duì)乳腺癌患者的研究相似(PD-L1在乳腺癌中的陽(yáng)性率為20.0%，TNBC亞型為38.0%)。同時(shí)，Meta分析表明，乳腺癌PD-L1陽(yáng)性率在0%～83%，大多數(shù)研究結(jié)果顯示PD-L1陽(yáng)性率低于50%[13～16]。對(duì)于TNBC亞型PD-L1陽(yáng)性率在5%～80%[16～18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達(dá)與腫瘤體積大、組織分化程度低、ER陰性、PR陰性、HER-2陽(yáng)性、Ki67高表達(dá)及分子分型等預(yù)后不良病理特征相關(guān)，提示PD-L1是腫瘤侵襲性較高的指標(biāo)。Bae等[14]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌PD-L1表達(dá)與組織分化程度低、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER陰性、PR陰性、HER-2陽(yáng)性及Ki67高表達(dá)相關(guān)。Qin等[15]發(fā)現(xiàn)PD-L1高表達(dá)與腫瘤體積大、血管侵犯、組織分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及ER陰性、PR陰性和HER-2陽(yáng)性相關(guān)。此外，Chen等[12]在食管鱗狀細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達(dá)并與腫瘤的部位、組織分化程度低、臨床分期晚及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān),需要進(jìn)一步研究其相關(guān)分子機(jī)制。與既往乳腺癌研究結(jié)果略有不同，筆者觀察到PD-L1表達(dá)患者術(shù)后OS及DFS時(shí)間較無(wú)PD-L1表達(dá)的患者更長(zhǎng)，但與患者OS及DFS無(wú)關(guān)。而在TNBC亞型，PD-L1表達(dá)與患者OS及DFS相關(guān)，且為其獨(dú)立預(yù)后因素[14～17]。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為乳腺癌及TNBC亞型的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，PR為乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。鑒于PD-L1的免疫抑制功能，與本研究中PD-L1上調(diào)是獨(dú)立的有利預(yù)后及預(yù)測(cè)因素似乎是矛盾的，生物學(xué)解釋可能是PD-L1表達(dá)是強(qiáng)細(xì)胞毒性局部免疫反應(yīng)的標(biāo)志物，本身是一種有利的預(yù)后和預(yù)測(cè)特征,在其他腫瘤內(nèi)也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果[10～12]。Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細(xì)胞癌PD-L1表達(dá)患者OS及DFS長(zhǎng)于PD-L1陰性患者。PD-L1表達(dá)也與高級(jí)別漿液性癌及肺鱗癌更好的生存預(yù)后相關(guān)[10，11]。

在乳腺癌研究中，Tsang等[16]研究發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)既不與整體OS相關(guān)，也不與DFS相關(guān)；在TNBC亞型，PD-L1表達(dá)與患者OS和DFS相關(guān)。Qin等[15]研究發(fā)現(xiàn)PD-L1高表達(dá)與乳腺癌患者較差的DFS和OS有關(guān)，且PD-L1是其獨(dú)立預(yù)后因素。Botti等[17]研究發(fā)現(xiàn)在TNBC亞型中PD-L1表達(dá)與DFS密切相關(guān)，但與OS無(wú)關(guān)。Sabatier等[13]發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)與TNBC患者OS及DFS相關(guān)。Bae等[14]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌PD-L1的表達(dá)與DFS和OS相關(guān)，但不是其獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。這些研究結(jié)果的差異，通常是由于PD-L1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判斷缺乏共識(shí)(如細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)、染色強(qiáng)度、僅計(jì)數(shù)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞或者還包括其他陽(yáng)性細(xì)胞類型)，以及個(gè)人對(duì)最佳陽(yáng)性截點(diǎn)的定義和解釋的主觀性造成。另外，腫瘤組織分析方法的差異(研究采用全組織切片、TMA或活檢標(biāo)本)也會(huì)引起結(jié)果不同。Wimberly等[19]研究發(fā)現(xiàn)，同一乳腺癌患者的活檢標(biāo)本，PD-L1的表達(dá)在視野之間變化可達(dá)4倍。其他器官腫瘤也表現(xiàn)出腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，例如肺癌之間的不一致性高達(dá)48%。在該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究，將有可能更好地理解PD-L1的表達(dá)及其對(duì)治療易感性和預(yù)后的影響。

綜上所述，PD-L1與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后具有一定相關(guān)性，在TNBC亞型中，PD-L1表達(dá)是其獨(dú)立的有利預(yù)后因素。根據(jù)PD-L1在腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)特征，筆者推測(cè)其可能與患者臨床治療療效相關(guān)，并有可能指導(dǎo)未來(lái)的免疫治療策略。然而，由于目前PD-L1結(jié)果判斷尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，故在PD-L1表達(dá)作為T(mén)NBC亞型可靠的生物學(xué)標(biāo)志物之前仍有許多問(wèn)題需要解決。