劉 瑩 陳興銀 譚 婷 劉長(zhǎng)青 湯順玉 李 響

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是全球三大癌癥死亡原因。胃癌在全球的發(fā)生率因地區(qū)而異，在東亞其發(fā)生率最高[1, 2]。大多數(shù)患者首診時(shí)即發(fā)現(xiàn)在癌癥晚期，已經(jīng)出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移。盡管近年來(lái)在外科技術(shù)和放、化療方面取得了較大進(jìn)展，然而晚期胃癌患者預(yù)后仍不理想[3]。因此，充分了解胃癌發(fā)展的潛在分子機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)志物和發(fā)掘新的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)迫在眉睫。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類(lèi)超過(guò)200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄物質(zhì)，其沒(méi)有編碼蛋白的潛能，但是多數(shù)研究表明LncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。LncRNA參與多種腫瘤生物學(xué)作用，包括腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡和化療藥物的抵抗[4]。研究表明LncRNA的失調(diào)在誘導(dǎo)胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[5]。DNM3OS是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，前期研究報(bào)道其在卵巢癌中通過(guò)誘導(dǎo)上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)卵巢癌的侵襲，降低其生存率。然而其在胃癌中的作用尚無(wú)報(bào)道。本研究旨在探討DNM3OS在胃癌患者中的表達(dá)及其與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，探討DNM3OS對(duì)胃癌細(xì)胞系的作用和機(jī)制，為胃癌的防治提供新的理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1.患者樣本:腫瘤及其癌旁組織來(lái)源于2012年1月～2016年1月在筆者醫(yī)院接受手術(shù)的胃癌患者。研究方案經(jīng)筆者醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。所有參與者均知情同意。所有患者在手術(shù)前均未接受放療或化療。所有胃癌組織標(biāo)本均取后立即快速冷凍在-80℃下儲(chǔ)存。采用電話隨訪的方式進(jìn)行隨訪，每半年1次，詢(xún)問(wèn)患者再入院情況和死亡情況。

2.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:人胃上皮細(xì)胞系A(chǔ)GS和 MKN45(上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))在含有10%胎牛血清(美國(guó)Sigma公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將2×105個(gè)細(xì)胞接種到6孔板中，用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。siRNA序列如下：si-DNM3OS: 5′-CAACTAGTGTTCAACTATA-3′。

3.RT-PCR檢測(cè)：提取胃癌組織和細(xì)胞的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶XL(日本TaKaRa公司)、寡核苷酸和隨機(jī)引物將1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用QuantStudio 5 real-time PCR 系統(tǒng)(美國(guó)Thermo fisher公司)以及SYBR green反應(yīng)試劑盒(美國(guó)Biosystems公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以肌動(dòng)蛋白β(β-actin)作為內(nèi)參。

4.免疫印跡法:提取胃癌組織和細(xì)胞的總蛋白，采用裂解液裂解蛋白后離心取上清總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，采用10%是SDS-page進(jìn)行凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVGF膜上，采用5%脫脂牛奶封閉30min，采用相應(yīng)的一抗孵育過(guò)夜，采用熒光二抗孵育1h，采用Odessey 紅外系統(tǒng)進(jìn)行顯色，所有蛋白與內(nèi)參β-actin進(jìn)行比較。

5.MTT試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖:細(xì)胞接種于96孔板中，處理完畢后每孔加入10μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。用PBS沖2～3遍后，每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀A490nm處測(cè)量各孔的吸光度值。

6.凋亡染色檢測(cè)：采用Tunel染色檢測(cè)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，處理好的細(xì)胞采用4%多聚甲醛固定15min，用預(yù)冷的乙醇和冰醋酸1∶1溶液后固定，采用0.2% TritonX 200通透細(xì)胞5min，孵育TUNEL反應(yīng)混合液1h，采用DAPI染色細(xì)胞核。以每個(gè)視野下綠色和藍(lán)色細(xì)胞核重疊百分?jǐn)?shù)作為細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)。

結(jié) 果

1.DNM3OS在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)升高:RT-PCT結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，DNM3OS在胃癌組織中的表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與正常細(xì)胞比較，AGS細(xì)胞系中DNM3OS的表達(dá)顯著增高(P<0.05)；與正常細(xì)胞比較，MKN45細(xì)胞系中DNM3OS的表達(dá)顯著增高(P<0.05)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 DNM3OS在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)升高

2.DNM3OS表達(dá)與胃癌患者腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分級(jí)相關(guān)性:納入的50例患者，以DNM3OS表達(dá)的中位數(shù)為界限，將其分為DNM3OS高表達(dá)組，DNM3OS低表達(dá)組，兩組患者的腫瘤組織分化程度、Bormann分型、腫瘤直徑和神經(jīng)侵犯率、血管侵犯率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而T分級(jí)、N分級(jí)和TNM分級(jí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表1。

3.DNM3OS表達(dá)與胃癌患者生存率的關(guān)系:隨訪患者36個(gè)月，統(tǒng)計(jì)患者病死率，DNM3OS高表達(dá)組患者死亡15例，病死率高達(dá)50%，而DNM3OS低表達(dá)組患者死亡4例，病死率為20%，兩組存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，生存率曲線詳見(jiàn)圖2。

4.DNM3OS沉默減少胃癌AGS細(xì)胞系的增殖，增加其凋亡：培養(yǎng)胃癌AGS細(xì)胞系，采用siRNA沉默DNM3OS的表達(dá)后其表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，證明siRNA的轉(zhuǎn)染是成功的。MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)12、24、48和72h，對(duì)照組AGS細(xì)胞不斷增殖，而DNM3OS沉默組(si-DNM3OS)細(xì)胞增殖明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，詳見(jiàn)圖3B。采用Tunel染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為5.6%±1.2%，DNM3OS沉默組細(xì)胞凋亡率為29.7%±4.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)圖3C。

表1 DNM3OS的表達(dá)與胃癌患者腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分級(jí)的關(guān)系

圖2 DNM3OS表達(dá)與胃癌患者生存率的關(guān)系兩組比較，*P<0.05

5.DNM3OS沉默減少胃癌MKN45細(xì)胞系的增殖，增加其凋亡：培養(yǎng)胃癌MKN45細(xì)胞系，采用siRNA沉默DNM3OS的表達(dá)后其表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，證明siRNA的轉(zhuǎn)染是成功的(圖4A)。MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)12、24、48和72h，對(duì)照組MKN45細(xì)胞不斷增殖，而DNM3OS沉默組(si-DNM3OS)細(xì)胞增殖明顯低于對(duì)照組(P<0.05，圖4B)。采用Tunel染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，結(jié)果顯示,

圖3 DNM3OS沉默減少胃癌AGS細(xì)胞系的增殖，增加其凋亡C.綠色為凋亡細(xì)胞，藍(lán)色為細(xì)胞核(×400);與siRNA對(duì)照組比較，*P<0.05

圖4 DNM3OS沉默減少胃癌MKN45細(xì)胞系的增殖，增加其凋亡C.綠色為凋亡細(xì)胞，藍(lán)色為細(xì)胞核(×400);與siRNA對(duì)照組比較，*P<0.05

對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為54.6%±1.9%，DNM3OS沉默組細(xì)胞凋亡率為30.7%±3.8%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4C)。

6.DNM3OS 調(diào)控Akt信號(hào)分子：免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，在AGS細(xì)胞系中，DNM3OS沉默組Akt的磷酸化水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05，圖5A)；在MKN45細(xì)胞系，DNM3OS沉默組Akt的磷酸化水平同樣明顯低于對(duì)照組(P<0.05，圖5B)。

圖5 DNM3OS 調(diào)控Akt信號(hào)分子

討 論

研究表明LncRNAs在腫瘤的各種生命過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這表明其可以作為判斷腫瘤預(yù)后的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[6,7]。目前為止，多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中多種LncRNA表達(dá)失調(diào)，包括GCLNC1、PANDAR、MALAT1、GCRL1[8～10]。本研究發(fā)現(xiàn)與相鄰正常組織比較,LncRNA DNM3OS在胃癌組織中顯著上調(diào)。且DNM3OS高表達(dá)的患者腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期明顯差于DNM3OS低表達(dá)患者。DNM3OS高表達(dá)患者的生存率也低于預(yù)后DNM3OS低表達(dá)患者。這些結(jié)果表明，DNM3OS可能是作為潛在的胃癌預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)志物。為了進(jìn)一步評(píng)估DNM3OS在胃癌細(xì)胞發(fā)展中的作用，筆者采用DNM3OS siRNA對(duì)兩種胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果表明，DNM3OS沉默抑制了胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。這些結(jié)果表明DNM3OS在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[11]。Akt是Akt/PI3K/PTEN信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白。Akt一旦被磷酸化激活，在惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著重要作用[11,12]。磷酸化Akt(P-Akt)通過(guò)激活下游的哺乳動(dòng)物雷帕霉素干擾細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)[13]。過(guò)度表達(dá)的P-Akt被認(rèn)為是許多惡性腫瘤預(yù)后不良的重要指標(biāo)[14～16]。一項(xiàng)Meta分析表明，P-Akt高表達(dá)與乳腺癌患者的總體生存率差顯著相關(guān)[17]。P-Akt表達(dá)升高與非小細(xì)胞肺癌患者生存率低顯著相關(guān)[18]。此外，P-Akt表達(dá)升高與胃癌患者預(yù)后差明顯相關(guān)[19]。而本研究發(fā)現(xiàn)，在DNM3OS沉默后AGS胃癌細(xì)胞系和MKN45胃癌細(xì)胞系中Akt的激活明顯下調(diào)，提示DNM3OS可能通過(guò)上調(diào)Akt促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡發(fā)揮促胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用。

綜上所述，DNM3OS在胃癌中高表達(dá)，其可能作為新的生物學(xué)標(biāo)志物用于判斷胃癌患者的預(yù)后；DNM3OS可能通過(guò)促進(jìn)Akt的活化促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生存和進(jìn)展。本研究為胃癌治療提供了新思路，未來(lái)基于DNM3OS為靶點(diǎn)的新藥物可能成為治療胃癌的新策略。