俞建順 陳芝蕓

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)被認(rèn)為是代謝綜合征的一種表現(xiàn)。在全世界范圍內(nèi)，NAFLD的發(fā)生率約為25%，在亞洲，這一數(shù)字大約是27.4%[1]。大多數(shù)NAFLD患者不表現(xiàn)出任何癥狀，其中有約20%的患者進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，NASH可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝細(xì)胞性肝癌等。時至今日，對于NASH的發(fā)病機(jī)制仍不十分確定，也缺乏有效的治療手段。目前比較廣為接受的是“二次打擊”學(xué)說。第1次打擊是肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的累積，脂質(zhì)的累積會導(dǎo)致肝臟損傷。飲食內(nèi)或脂肪組織釋放的多余游離脂肪酸以及肝臟內(nèi)脂肪酸合成增加及分解減少均會導(dǎo)致脂質(zhì)累積。第2次打擊包括多種因素，例如細(xì)胞凋亡、壞死，氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，促炎細(xì)胞因子的表達(dá)和線粒體功能失調(diào)，所有這些功能失常逐漸導(dǎo)致NAFLD進(jìn)展為NASH和纖維化。盡管已經(jīng)知道是第2次打擊促進(jìn)了NAFLD向NASH的發(fā)展，但目前為止還沒有足夠證據(jù)能夠解釋其中的分子機(jī)制。最新研究發(fā)現(xiàn)，炎癥小體在NASH的發(fā)展中起到了重要作用，現(xiàn)對NASH和炎癥小體的關(guān)系進(jìn)行綜述。

一、炎癥小體概述

炎癥小體是細(xì)胞內(nèi)多蛋白復(fù)合物，在自身免疫性疾病、感染性和代謝性疾病中具有重要地位，是固有免疫的重要組成部分。目前為止，已證明多種炎癥小體的存在，包括NLRP1、2、3、6、10、12、NLRC4和AIM2等。盡管在配體的識別、下游信號通路和生物功能等方面，各個炎癥小體之間存在差異，但是幾乎所有的炎癥小體的核心功能都是激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(Casp1)。

大多數(shù)炎癥小體以NOD樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain protein-like receptor，NLR)為核心，通過其識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，經(jīng)含有CARD(caspase recruitment domain)的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)這一銜接蛋白使Casp1前體激活成為Casp1，活化的Casp1能夠促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的成熟，從而發(fā)揮效應(yīng)[2]。

炎癥小體主要由固有免疫細(xì)胞表達(dá)，例如單核-吞噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等，在一些非免疫細(xì)胞中也有表達(dá)，例如角化細(xì)胞、肝細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞等。具體來說，NLRP3炎癥小體主要在粒-單核細(xì)胞系細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，在受到炎性刺激的時候，單核-吞噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的表達(dá)顯著增加。另外還有報道T細(xì)胞、B細(xì)胞、口腔及生殖道上皮細(xì)胞、皮膚角質(zhì)細(xì)胞和軟骨細(xì)胞也都能表達(dá)NLRP3炎癥小體[3]。NLRP6炎癥小體主要在腎臟、肝臟、肺、小腸和大腸內(nèi)表達(dá)，在腸道內(nèi)，NLRP6主要由腸上皮細(xì)胞和結(jié)腸杯狀細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，且和腸道微生物的組成有一定關(guān)系，另外，結(jié)腸內(nèi)的成纖維細(xì)胞也可表達(dá)NLRP6[4]。NLRC4炎癥小體在巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和腸道上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和激活[5]。AIM2炎癥小體主要位于細(xì)胞質(zhì)中，可在脾臟、小腸和外周血中檢測到，在EV-A71感染的患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)明顯增加，且和多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，在結(jié)腸癌、前列腺癌和肝癌組織中均可檢測到其異常表達(dá)[6]。

一般來說，模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)由病原體來源的抗原激活。NLR作為PRR的一種，同樣如此。例如NLRP1炎癥小體可由炭疽毒素激活，NLRP3炎癥小體可由細(xì)菌來源的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、病毒等激活，NLRC4可由沙門菌鞭毛蛋白激活，AIM2可由痘苗病毒激活。但是，除此之外，NLR同樣也能由內(nèi)源性的分子激活，例如NLRP1可被化學(xué)療法激活，NLRP2可被ATP激活，NLRP3炎癥小體可由多余ATP、葡萄糖、神經(jīng)酰胺、活性氧簇、氧化LDL、尿酸和膽固醇結(jié)晶激活，AIM2可由DNA激活[7]。

研究證明，脂肪酸和LPS通過激活炎癥小體在NASH的發(fā)展中起到了重要作用。食物中的飽和脂肪酸(棕櫚酸)能夠誘導(dǎo)Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)2和TLR1形成二聚體，促進(jìn)NLRP3的表達(dá)，刺激單核細(xì)胞釋放IL-1β，從而導(dǎo)致外周組織的炎癥[8]。棕櫚酸在肝臟內(nèi)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和caspase-8的活化，從而導(dǎo)致危險信號的釋放，并能增加肝細(xì)胞對脂多糖的敏感度，從而激活肝細(xì)胞內(nèi)炎癥小體，通過激活肝內(nèi)單核細(xì)胞放大炎性反應(yīng)，導(dǎo)致肝損的發(fā)生[9]。另一項研究顯示，LPS的單獨刺激足夠引起肝臟NLRP3炎癥小體活化通路下游炎性細(xì)胞因子的生成[10]。一般認(rèn)為，革蘭陰性菌感染后能夠促進(jìn)宿主細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體(NLRP3、ASC和Casp1前體復(fù)合物)形成，其細(xì)胞壁內(nèi)的LPS能夠由細(xì)胞表面的受體TLR4和MD2共受體復(fù)合物識別，經(jīng)一條TRIF銜接蛋白和1型干擾素參與的信號通路調(diào)控Casp11的表達(dá)，從而促進(jìn)Casp1前體向Casp1轉(zhuǎn)化[11]。

二、炎癥小體與NASH

1.肝臟內(nèi)炎癥小體與NASH:肝臟炎癥小體主要存在于庫普弗細(xì)胞、肝實質(zhì)細(xì)胞、肝內(nèi)皮細(xì)胞及星狀細(xì)胞內(nèi)。Dixon等[12]研究發(fā)現(xiàn)使用蛋氨酸、膽堿缺乏飲食(MCDD)喂養(yǎng)誘導(dǎo)的小鼠NASH模型和使用普通飲食喂養(yǎng)的小鼠比較，肝內(nèi)出現(xiàn)炎癥小體激活和Casp1表達(dá)增加，并且伴有ASC mRNA表達(dá)水平升高；MCDD喂養(yǎng)的Casp1-/-小鼠和野型(wild type，wt)小鼠比較，多種炎性因子mRNA表達(dá)減少，說明Casp1的激活能夠促進(jìn)NASH進(jìn)程中炎癥的發(fā)展。同樣，Csak等[9]的研究也證明了MCDD誘導(dǎo)的NASH的發(fā)生和肝內(nèi)炎癥小體相關(guān)蛋白(NLRP3、ASC和Casp1)表達(dá)的增加有關(guān)。此兩項研究還發(fā)現(xiàn)，MCDD誘導(dǎo)的NASH小鼠肝內(nèi)IL-1β水平顯著升高，而IL-18卻無明顯變化[12]。

炎癥小體的激活同樣能夠促進(jìn)其他飲食誘導(dǎo)的NASH發(fā)展。使用高脂飲食(HFD)喂養(yǎng)的NLRP3-/-、ASC-/-、Casp1-/-小鼠和wt小鼠比較，肝細(xì)胞脂肪變度較輕，肥胖程度較輕，胰島素敏感度較好，說明NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的缺失能夠抑制HFD誘導(dǎo)的NASH的進(jìn)展，且IL-1β能夠促進(jìn)NASH的發(fā)展[13]。而使用膽堿缺乏氨基酸(CDAA)飲食喂養(yǎng)的小鼠進(jìn)行實驗，結(jié)果同樣支持肝內(nèi)(主要為庫普弗細(xì)胞)NLRP3炎癥小體的激活會加重NASH進(jìn)程和胰島素抵抗這一結(jié)論，且該NASH的發(fā)展也和IL-1β有關(guān)[14]。

而在體外實驗方面，Luo等[15]研究證明了通過抑制NLRC4炎癥小體的活化、Casp1的激活及IL-1β的裂解，能夠減輕PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積和炎癥，同樣說明肝細(xì)胞內(nèi)NLRC4炎癥小體的激活會促進(jìn)NASH的發(fā)展(圖1)。

圖1 各臟器炎癥小體對NASH發(fā)生與發(fā)展的影響

2.腸道炎癥小體與NASH:腸道菌群的失調(diào)和NASH的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，而在這其中，炎癥小體扮演了重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥小體相關(guān)蛋白的缺陷(NLRP3-/-、NLRP6-/-、Casp1-/-小鼠)和上皮完整性及腸道炎癥有關(guān)，后者可以導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)及菌血癥的發(fā)生，炎癥小體的表達(dá)對腸道菌群的組成具有重塑作用[16, 17]。

Henao-Mejia等[18]研究發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)NLRP3和NLRP6炎癥小體的缺陷可致腸道微生物發(fā)生改變，誘導(dǎo)結(jié)腸炎的發(fā)生，從而促進(jìn)NASH的進(jìn)展。腸上皮細(xì)胞內(nèi)NLRP6和NLRP3炎癥小體在維持腸道正常微生物生態(tài)平衡中起到了至關(guān)重要的作用，兩者通過介導(dǎo)IL-18的激活維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，當(dāng)其出現(xiàn)缺陷時，小鼠腸道內(nèi)擬桿菌門細(xì)菌(屬普雷沃菌科)和TM7菌門細(xì)菌增加，乳酸菌屬細(xì)菌(屬厚壁菌門)減少，這一菌群被稱為致結(jié)腸炎菌群(colitogenic microbiota)，這一菌群會誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分泌CCL5，導(dǎo)致自發(fā)性和誘發(fā)性結(jié)腸炎的發(fā)生。而包括AIM2、NLRC4、NLRP10和NLRP12在內(nèi)的其他炎癥小體的缺陷均不會導(dǎo)致小鼠腸道致結(jié)腸炎菌群的發(fā)生。結(jié)腸炎的發(fā)生使腸黏膜屏障破壞，腸壁通透性增加，細(xì)菌產(chǎn)物(作為TLR4和TLR9激動劑，具體成分尚不清楚)透過腸壁進(jìn)入門脈循環(huán)到達(dá)肝臟，激活肝內(nèi)TLR4和TLR9。TLR4/9能夠誘導(dǎo)肝內(nèi)TNF-α的生成，從而加重MCDD誘導(dǎo)的NASH[18]。

同樣，Pierantonelli等[19]使用高脂高糖飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的NASH小鼠模型，也得出了類似的結(jié)論，高脂高糖飲食喂養(yǎng)的NLRP3-/-小鼠腸道內(nèi)免疫應(yīng)答的紊亂、抗菌肽表達(dá)的破壞、腸道通透性的增加以及腸道菌群的紊亂共同導(dǎo)致腸道菌群的易位，從而進(jìn)一步加重NASH的進(jìn)展。高脂高糖飲食喂養(yǎng)的NLRP3-/-小鼠肝臟損傷程度較野生型小鼠肝臟損傷程度加重，同時伴有革蘭陰性菌(變形菌門及疣微菌門)數(shù)量的增加，這兩種細(xì)菌能夠降解腸道黏液，從而導(dǎo)致細(xì)菌易位的發(fā)生(圖1)[19～21]。

綜上所述，腸道內(nèi)炎癥小體(NLRP3及NLRP6炎癥小體)的激活能夠保護(hù)腸黏膜屏障，從而抑制NASH的發(fā)展，且該炎癥小體激活通路下游的效應(yīng)因子主要是IL-18。肝臟內(nèi)炎癥小體(主要是NLRP3炎癥小體)的激活則會促進(jìn)NASH進(jìn)展，而該炎癥小體激活通路下游的效應(yīng)因子主要是IL-1β。

Chen等[22]研究發(fā)現(xiàn)，NLRP6-/-小鼠和wt小鼠比較，葡聚糖硫酸酯鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎明顯加重，血清中和肝內(nèi)IL-18水平的顯著下降。Minicis等[23]在實驗中同時測定了腸道內(nèi)和肝內(nèi)炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)。該研究發(fā)現(xiàn)HFD喂養(yǎng)導(dǎo)致的腸道微生物紊亂能夠促進(jìn)膽管結(jié)扎(bile duct ligation，BDL)誘導(dǎo)的肝損傷和肝纖維化，而在該過程中，小鼠肝內(nèi)TLR4和TLR9 mRNA的表達(dá)顯著增加，炎癥小體相關(guān)蛋白(包括NLRP3和ASC)的表達(dá)均顯著升高，炎癥小體活化的產(chǎn)物Casp1和IL-18同樣有所升高。而在腸道內(nèi)(尤其指腸上皮細(xì)胞)則恰好完全相反：HFD+BDL組小鼠盲腸中TLR4和TLR9基因及NLRP3、ASC、Casp1和IL-18的表達(dá)均顯著下降。這似乎也說明了炎癥小體在不同器官中起到了不同作用，對肝損傷起促進(jìn)作用，但對腸道通透性和細(xì)菌易位起保護(hù)作用。然而，無論是肝內(nèi)還是腸內(nèi)，炎癥小體功能的失調(diào)均會對NASH的發(fā)展產(chǎn)生影響。

需要指出的是，Henao-Mejia等[18]和Dixon等[12]的研究中同樣使用了Casp1-/-小鼠，Casp1基因的敲除影響的是體內(nèi)所有器官內(nèi)Casp1的表達(dá)，不存在器官特異性，而兩者在MCDD的喂養(yǎng)下卻出現(xiàn)了相反的結(jié)果。經(jīng)過比較，兩個研究的實驗過程并未存在明顯不同，因此筆者大膽推測，這可能和實驗小鼠初始狀態(tài)下腸道菌群的差異有關(guān)，這也將成為課題組后期的工作之一。另外，Henao-Mejia等[18]的實驗還發(fā)現(xiàn)，和wt小鼠比較，CD11c+骨髓細(xì)胞(Nlrp3KI;CD11c+-Cre)或肝細(xì)胞(Nlrp3KI;Albumin-Cre)特異性表達(dá)活化形式的NLRP3炎癥小體的基因敲入小鼠在MCDD誘導(dǎo)的NASH嚴(yán)重程度上無明顯區(qū)別，因此認(rèn)為髓系細(xì)胞和肝細(xì)胞以外的細(xì)胞炎癥小體功能失常是導(dǎo)致炎癥小體缺陷小鼠NASH發(fā)展的決定因素。而上述多個研究表明肝組織內(nèi)肝細(xì)胞以及庫普弗細(xì)胞內(nèi)的炎癥小體在NASH的發(fā)展中起到了重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，髓系細(xì)胞特異性NLRP3炎癥小體活化會導(dǎo)致嚴(yán)重的肝炎和纖維化[24]。同樣，庫普弗細(xì)胞中炎癥小體的激活會導(dǎo)致膽固醇外流減少和自噬作用的失調(diào)，刺激膽固醇結(jié)晶的形成，導(dǎo)致肝炎的發(fā)生，這與Henao-Mejia等得出的結(jié)論存在沖突[25]。筆者推測，Henao-Mejia等[18]的研究使用的骨髓和肝細(xì)胞特異性表達(dá)NLRP3炎癥小體的基因敲入小鼠體內(nèi)存在持續(xù)的NLRP3炎癥小體激活，而在MCDD的誘導(dǎo)下，wt小鼠骨髓細(xì)胞和肝細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體被激活，同樣出現(xiàn)了顯著的肝炎表現(xiàn)，這可能反而更加能說明髓系細(xì)胞和肝細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的激活在NASH中起到的重要作用。另外還有研究發(fā)現(xiàn)NLRP6炎癥小體對腸道微生物的組成并無影響，且不影響DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[26]。該研究認(rèn)為，這可能是因為Henao-Mejia等[18]的研究未使用同窩小鼠，NLRP6-/-小鼠的致結(jié)腸炎菌群是隨機(jī)獲得的，和基因型無關(guān)，但具體原因有待于進(jìn)一步研究。

三 炎癥小體與NASH相關(guān)肝纖維化

目前關(guān)于炎癥小體和NASH肝纖維化關(guān)系的研究主要集中在NLRP3炎癥小體上。Wree等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3-/-小鼠可免于長期CDAA飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肝腫大、肝損傷及活化巨噬細(xì)胞的浸潤。更重要的是，CDAA飲食喂養(yǎng)的NLRP3-/-小鼠肝纖維化顯著減輕。而經(jīng)過短期(4周)的CDAA飲食喂養(yǎng)，NLRP3基因敲入小鼠體內(nèi)持續(xù)的NLRP3激活會誘導(dǎo)肝內(nèi)嚴(yán)重的炎癥(炎癥評分增加，Casp1及IL-1β前體mRNA水平升高)、巨噬細(xì)胞浸潤、HSC的激活和明顯的肝纖維化發(fā)生，而同樣飲食喂養(yǎng)的WT小鼠則只有輕度的單純性肝臟脂肪變性。這些結(jié)果共同說明NLRP3炎癥小體的激活參與NAFLD肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

另外，該研究還對NAFLD疾病譜不同階段(主要分為NASH患者及非NASH患者)的患者肝組織進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NASH患者肝組織內(nèi)NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白(NLRP3、IL-1β前體、IL-18前體)表達(dá)顯著高于非NASH患者，且I型膠原A1(collagen type I alpha 1,COL1A1)和IL-1β前體的mRNA兩者的水平具有相關(guān)性。膠原沉積是肝纖維化的重要表現(xiàn)，這同樣支持NLRP3炎癥小體的激活在NAFLD患者肝纖維化進(jìn)展中起到了重要作用。

研究認(rèn)為，肝細(xì)胞及肝非實質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體信號通路激活后，Casp1活化，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡的發(fā)生，HSC內(nèi)NLRP3信號通路的激活則會導(dǎo)致膠原沉積的加劇，而這兩者均會導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[24,28，29]。NLRP3炎癥小體激活導(dǎo)致肝纖維化，其下游的效應(yīng)因子IL-1β起到了重要作用，而有研究使用阿那白滯素(一種IL-1受體拮抗劑)治療NLRP3炎癥小體激活小鼠，其肝臟炎癥可得到部分緩解，但HSC的活化及肝纖維化則無明顯影響，這說明NLRP3炎癥小體的激活導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的信號通路下游除IL-1β外還有其他效應(yīng)因子，而這其中可能就包括TNF信號通路[24，30]。

四、展 望

社會的發(fā)展、生活水平的提高，帶來的是日益嚴(yán)重的肥胖問題，也正因為如此，非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生率逐年升高。作為代謝綜合征的一部分，NAFLD/NASH和糖尿病、高脂血癥等疾病往往是互相伴隨的，且NAFLD/NASH已成為隱源性肝硬化的最主要原因。目前為止，對于NAFLD/NASH的治療仍然主要局限在生活方式的改變、減重等發(fā)面，藥物治療的效果并不確切，因此，進(jìn)一步明確本病的發(fā)病機(jī)制，尋找治療靶點，開發(fā)新的藥物迫在眉睫。綜上所述，炎癥小體直接參與到NAFLD疾病譜中單純性脂肪變向NASH的轉(zhuǎn)變及進(jìn)一步肝纖維化的發(fā)生中，在NASH的發(fā)生與發(fā)展中起到了重要的作用。但是，目前研究基本集中在NLRP3和NLRP6炎癥小體，且尚處于比較初級的階段，研究并不是十分徹底，甚至在一些問題上許多研究之間還產(chǎn)生了明顯的分歧，尤其是在不同器官內(nèi)炎癥小體對NASH的影響，部分研究甚至出現(xiàn)了相反的結(jié)果。但是，相信隨著對炎癥小體進(jìn)一步深入研究，對NASH的認(rèn)識會越來越深入。