陳 英，劉中寧，李 波，姜 婷△

(1. 北京大學口腔醫(yī)學院·口腔醫(yī)院，修復科 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術和材料國家工程實驗室 口腔數(shù)字醫(yī)學北京市重點實驗室，北京 100081； 2. 重慶科技學院納微復合材料與器件重慶市重點實驗室，重慶 401331)

非甾體類抗炎藥物阿司匹林(acetylsalicylic acid, aspirin)是臨床常用的藥物，價格低廉，近年來的研究顯示，阿司匹林在骨代謝中發(fā)揮著重要作用，同時具有顯著的抗炎和促礦化作用[1-2]。本課題組將可注射性溫敏海藻酸/羧化聚N-異丙基丙烯酰胺/β-TCP復合凝膠(thermo-sensitive alginate hydrogel-g-PNIPAAm/β-TCP, TSAH/β-TCP)作為支架材料，在兔下頜骨和大鼠顱骨誘導成骨中獲得了肯定的成骨效果[3-4]。但是，由于阿司匹林屬于小分子，在傳統(tǒng)支架材料中存在用藥即刻突釋現(xiàn)象，長期作用效果受到很大局限，其誘導形成的新生組織仍處于礦化早期，因此，建立一種阿司匹林的緩釋體系，對于其在成骨研究中的應用至關重要。

緩釋的作用機制是將藥物通過化學接枝或物理包裹方式與載體結合，隨著化學鍵的斷裂或載體的降解而實現(xiàn)藥物緩慢釋放，從而達到延長藥物作用周期和減少毒副作用的目的[5]?；瘜W接枝的難點在于合適化學鍵的選擇和藥物特性的維持[6]，而阿司匹林極易發(fā)生水解形成水楊酸而喪失其療效[7]，因此，相對于化學接枝而言，物理包裹方式更有利于阿司匹林保持藥效和長期緩釋。

常見的微球型藥物載體可分為天然有機類和人工合成類，將阿司匹林包裹于海藻酸[8]、殼聚糖/聚乙烯醇[9]等天然有機類微球載體中能取得一定的緩釋效果，但存在緩釋時間短、載藥率低和需手術有創(chuàng)植入等缺陷。人工合成類高分子聚合物聚乳酸羥基乙酸(polylactic-co-glycolic acid, PLGA)微球，粒徑小，降解速率可調控，可塑性強，并且可以制成注射型制劑，具有操作方便、微創(chuàng)等優(yōu)點而受到廣泛應用。

在骨組織工程支架材料中，生物陶瓷和有機聚合物結合的復合支架具有良好的生物相容性、柔韌性以及機械性能，能長期釋放鈣離子，有利于成骨微環(huán)境形成等優(yōu)點。生物陶瓷類硅酸鈣(calcium silicate, CaSiO3)是一種可降解材料，具有良好的生物相容性和骨傳導性，與傳統(tǒng)的鈣磷類生物陶瓷相比，其能夠更有效地促進早期骨形成[10-11]。在藥物緩釋方面，其表面及內部疏松多孔結構能夠吸附大量藥物，載藥率較高。

我們擬構筑PLGA與CaSiO3復合型微球載體，利用CaSiO3材料增強支架機械性能，并通過表面多孔結構物理性藥物吸附，實現(xiàn)部分藥物的早期快速釋放，同時利用PLGA包載藥物，實現(xiàn)藥物隨PLGA降解緩慢長期釋放，通過二者協(xié)同作用，獲得阿司匹林的理想釋放方式，以期在骨缺損局部發(fā)揮抗炎和促進成骨的長期效果，達到促進骨再生的目的。

1 材料與方法

1.1 合成制備三種緩釋微球

為了探究PLGA、CaSiO3以及兩者復合后的aspirin緩釋性能，我們合成了三種微球體系，合成的組成比例見表1，具體合成方法如下。

表1 三種緩釋微球支架合成組分比例Table 1 The compositions of three kinds of scaffolds

PLGA, poly lactic-co-glycolic acid; CaSiO3, calcium silicate; PVA, polyvinyl alcohol; w, weight; v, volume.

1.1.1CaSiO3+aspirin微球制備 單純物理浸提液法合成，稱取10 mg CaSiO3微球(重慶科技學院提供)，浸泡于1 mL 10 g/L的aspirin (≥99%, 相對分子質量180.16，Sigma, 美國)水溶液中，置于TS-1000脫色搖床(其林貝爾儀器制造有限公司，海門市)輕輕震蕩2 h(轉速為100 r/min)，棄去上層液體，置于冷凍干燥機(BILON公司，上海)過夜。

1.1.2PLGA+aspirin微球制備 水包油(oil/water，O/W)乳化法合成，在10 g/L aspirin的二氯甲烷(DCM, 北京化工廠)溶液中加入100 mg PLGA(體積比50 ∶50，相對分子質量7 000～17 000，Sigma, 美國)，冰水浴中使用磁力攪拌機(轉速為200 r/min，金北德工貿有限公司，中國)攪拌20 min，將得到的懸濁液倒入3 mL 2%(質量分數(shù))的聚乙烯醇(PVA，≥99%, 相對分子質量85 000～124 000，Sigma, 美國)溶液中，旋渦震蕩30 min(轉速為2 000 r/min)， 靜置30 min，TDZ4-WS低速臺式離心機(湘儀離心機儀器有限公司, 中國)分離離心，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)超聲清洗3遍，冷凍干燥過夜，真空儲存。

1.1.3PLGA+CaSiO3+aspirin微球制備 同樣采用O/W乳化法合成，CaSiO3微球使用高通量組織破碎儀(Qiagen公司，德國)攪拌1 min(轉速為10 000 r/min)， 稱取一定量的CaSiO3粉末加入至含有aspirin和PLGA的DCM溶液中，并通過調整PLGA與CaSiO3的比例，得到材料的最佳形貌。

1.2 微球形態(tài)觀察及粒徑測定

分別取少量上述三種微球支架，于Hitachi S-4800環(huán)境掃描電鏡(Hitachi公司，日本)下觀察微球的外觀形態(tài)，應用Nano Measurer軟件測量微球的粒徑及其分布。

1.3 阿司匹林標準溶液的配置及微球載藥率測定

Thermo NanoDrop 8000分光光度計(Thermo公司，美國)檢測aspirin溶液最大吸收波長為275 nm。配制不同濃度(31.2、62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 mg/L)的標準aspirin溶液，檢測其在275 nm處的光密度值(D)，繪制標準曲線。

三組緩釋微球支架隨機各稱取20 mg制備的微球，泡于1 mL DCM中，每組設置4個樣本，共12個樣本，搗碎靜置，以分光光度計測各樣本上清液275 nm處的吸收波長值，根據aspirin 275 nm處的標準曲線計算aspirin濃度，載藥率=(微球含藥量/微球實際重量)×100%。

1.4 載藥率的統(tǒng)計學分析

載藥率使用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，任意兩組之間運用LSD做組間差異的統(tǒng)計學處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 三種緩釋微球支架藥物緩釋效果評估

分別稱取一定量制備的微球支架置于3個15 mL離心管中，均各自浸泡于1 mL PBS，置于恒溫振蕩器37 ℃恒溫振蕩，40 r/min。分別于第1、2、4、6、9、13、17、21、24、30、36、45天時間點取20 μL浸提液測275 nm處的光密度值，同時加入20 μL新配制預熱的PBS，在此過程中無換液，計算aspirin濃度，此濃度即為該時間點aspirin的累積釋放濃度，繪制累積釋放曲線。

2 結果

2.1 三種微球的形貌及粒徑分布

在環(huán)境掃描電鏡下觀察可見，三種微球支架成球規(guī)整，表面光滑，基本無粘連，分布較均勻，而PLGA+CaSiO3+aspirin支架中，微球均勻分布在CaSiO3粉末中，較少出現(xiàn)微球破裂及團聚現(xiàn)象。應用Nano Measurer軟件測量微球的粒徑及其分布，CaSiO3+aspirin、PLGA+aspirin、PLGA+ CaSiO3+aspirin的平均粒徑分別為(177.2±29.6) μm、(0.9±0.3) μm、(5.3±1.8) μm，各自主要分布在150～200 μm、0.6～1.3 μm、4.0～8.7 μm范圍內(圖1)。

2.2 阿司匹林標準曲線的繪制及微球載藥率評估

用Thermo NanoDrop 8000分光光度計測量275 nm處吸收波長，繪制標準曲線(圖2A)，得線性回歸方程：C=3.292D+0.023，R2=0.998，表明aspirin在30～1 000 mg/L的濃度范圍內，濃度C與光密度D之間有很好的線性關系。計算CaSiO3+aspirin、PLGA+aspirin、PLGA+CaSiO3+aspirin的藥物載藥率，并進行統(tǒng)計學分析(圖2B)，三種微球支架的載藥率分別為(1.06±0.04)%、(7.05±0.06)%和(6.75±0.18)%。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，任意兩組間運用LSD做組間差異的統(tǒng)計學處理，其中PLGA+aspirin、PLGA+CaSiO3+aspirin的載藥率均明顯高于CaSiO3+aspirin組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，PLGA+aspirin與PLGA+CaSiO3+aspirin兩組間載藥率差異無統(tǒng)計學意義，說明PLGA通過物理包被作用負載藥物能力明顯高于CaSiO3物理吸附作用負載藥物能力。

2.3 三種微球支架緩釋效果評估

于固定時間點測定光密度，計算其濃度，繪制aspirin累積釋放曲線(圖3)。三種微球支架釋放總量95%的時間分別為3 d、24 d和36 d，CaSiO3+aspirin微球突釋現(xiàn)象較明顯，PLGA+aspirin微球初期24 h釋放困難，PLGA+CaSiO3+aspirin微球支架釋放時間明顯延長，無明顯突釋以及初期難以釋放等問題，且釋放速率更為穩(wěn)定。

A-C, CaSiO3+aspirin; D-F, PLGA+aspirin; G-I, PLGA+CaSiO3+aspirin.圖1 三種微球掃描電鏡圖及粒徑分布圖Figure 1 Scanning electron microscope photographs and size distribution of the three kinds of scaffolds

圖2 阿司匹林標準曲線(A)和三種微球支架的載藥率(B)Figure 2 Standard curve of aspirin (A) and aspirin loading efficiency of scaffolds (B)

3 討論

在臨床骨缺損的修復治療中，感染的預防和控制、促礦化效果及血管化效果是促進骨再生的關鍵。因創(chuàng)傷和生物材料的植入，缺損區(qū)域常存在炎癥和免疫反應。由于組織損傷和感染刺激因素的長期作用，導致缺損區(qū)慢性炎癥及免疫調節(jié)的失衡，巨噬細胞和T淋巴細胞大量聚集，M1巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1β、MCP-1、MIP-1等大量炎癥因子，其中TNF-α、IL-1β等炎癥因子能夠激活NF-κB通路，增強破骨細胞的活性，抑制成骨細胞及間充質干細胞活性[12]，同時，活化的T淋巴細胞表達FasL，通過與成骨細胞表達的Fas結合，介導骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSC)的凋亡[13]，導致骨再生的失敗。因此，將具有抗炎和免疫調節(jié)作用的藥物復合到骨組織工程支架材料中并適當調控其釋放，有望抑制骨缺損和生物材料植入造成的早期炎癥和過度免疫反應，從而形成促進骨再生的微環(huán)境。

圖3 阿司匹林三種微球支架的累積釋放曲線Figure 3 In vitro release of scaffolds loaded with aspirin

以往大量研究探討了促成骨生長因子(BMP2、BMP7等)和促血管生成因子(VEGF、bFGF等)對成骨的作用[14-16]。生長因子可以促進骨髓間充質干細胞增殖、分化，形成血管化的新生骨組織，但是BMP2等成骨生長因子具有成骨效果不可控、費用高昂等風險[17]，臨床應用受到限制。非甾體類抗炎藥物阿司匹林是臨床常用的藥物，價格低廉，近年來的研究顯示，阿司匹林在骨代謝中發(fā)揮著重要作用，同時具有顯著的促礦化和抗炎作用[1-2]。阿司匹林通過抑制IKBα磷酸化及降解，抑制p50/p65磷酸化及其相關細胞信號分子ERK、p38和JNK的表達[18]，同時，阿司匹林可以顯著降低TNF-α和IFN-γ的表達[19]，阻斷NF-κB信號通路激活對成骨的不良影響。在免疫調節(jié)方面，阿司匹林還能夠抑制T細胞介導的Fas通路對BMMSC的凋亡作用[13]。通過促進磷酸化β-連環(huán)蛋白的降解，激活Wnt信號通路，提高Runx2的表達，進而促進成骨[13,20]。此外，阿司匹林通過降低RANKL的表達，提高OPG的表達，抑制破骨細胞的分化[21]。本課題組的前期研究證實了可注射溫敏海藻酸鈉復合凝膠中添加阿司匹林可以有效提高新生組織的礦化體積和密度[3-4]，但是依然存在藥物釋放難以理想控制等問題。因此，本文主要從材料角度出發(fā)，期望獲得更為理想的藥物緩釋方式，對于今后緩釋的研究有一定指導意義，并可作為后續(xù)體內骨修復實驗的重要前期研究。

常見的藥物載體可分為天然有機類以及人工合成類[22]，人工合成類CaSiO3陶瓷具有骨傳導性、生物相容性、釋放硅鈣等離子形成利于成骨微環(huán)境等特點[23]，但在藥物緩釋方面，其表面疏松多孔的結構使其釋放周期較短，存在明顯的突釋現(xiàn)象，調整其孔隙率及孔徑等因素對其緩釋周期無明顯改善[24]。人工合成類的可降解材料(如PLGA)因其良好的生物相容性，可以通過調整其組分比例、相對分子質量以及化學結構來控制其降解速率，而且PLGA微球較大的比表面積因其能夠促進細胞黏附、增殖、分化能力[24]的特點受到廣泛應用，但是，PLGA微球作為一種單組分支架，機械性能不足且易發(fā)生團聚，會導致初期藥物釋放困難，因此，本研究旨在結合CaSiO3和PLGA的性能優(yōu)點，探索一種更為理想的復合微球支架材料。

本研究通過水包油乳化法，將CaSiO3和PLGA復合為新的微球體系，通過PLGA的包被作用負載大部分阿司匹林藥物，利用了CaSiO3材料表面多孔結構和吸附能力，使微球表面吸附一部分阿司匹林藥物，從而形成了一個立體多層次的載藥體系。通過CaSiO3和PLGA協(xié)同作用，提高了微球的機械強度，成功解決了單純CaSiO3負載藥物存在明顯突釋現(xiàn)象、PLGA載藥微球初期釋放困難等難題，達到了阿司匹林的理想緩釋方式。我們進一步提出設想，CaSiO3材料表面吸附的阿司匹林在體內植入初期，會在短時間內較大量釋放，從而有利于將材料植入區(qū)域炎癥控制在一個較低范圍，建立利于骨再生的微環(huán)境，保證局部免疫調節(jié)的平衡，后期隨著PLGA的降解，包載于PLGA中的阿司匹林緩慢長期釋放，促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，實現(xiàn)理想的骨再生效果。

在支架合成方面，本研究中PLGA+CaSiO3+aspirin復合微球的合成步驟簡便，成分簡單穩(wěn)定，具有生物安全性和較高的機械性能，同時，該復合微球粒徑在微納米級別范圍，可制成注射劑型，具有可塑性強和微創(chuàng)的特點。與臨床上治療骨缺損采用的人工骨粉或自體骨移植相比，復合微球可減輕患者的痛苦，大大降低了成本。同時，復合微球對于阿司匹林的改良緩釋方式，有望實現(xiàn)抑制炎癥調節(jié)免疫的效果，從而建立理想的成骨微環(huán)境。

綜上所述，PLGA+CaSiO3+aspirin復合微球具有較理想的aspirin緩釋效果，有望成為更為理想的成骨材料。