急性心肌梗死(AMI)是全球死亡和殘疾的主要原因之一，每6例AMI病人中死亡1例[1]。AMI的快速正確診斷在疾病的治療和預(yù)后中起著重要作用。在過去幾十年中，AMI的診斷、治療和預(yù)后方面取得了巨大進(jìn)展。特別是AMI生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展引起了人們的極大關(guān)注。目前，心肌肌鈣蛋白(cTn)是臨床實(shí)踐中用于診斷AMI的最常見生物標(biāo)志物。然而，cTn測定在AMI發(fā)病后的即刻階段缺乏足夠的敏感性，臨床上仍然需要新的生物標(biāo)志物，在入院時(shí)快速可靠地診斷或排除AMI。微小RNA(microRNA，miR)是調(diào)節(jié)特定信使RNA的穩(wěn)定性和(或)翻譯效率的非編碼RNA分子。研究表明，miR是AMI早期診斷潛力巨大的新型生物標(biāo)志物[2]。miR的組織表達(dá)水平的異常變化與心臟病直接相關(guān)。除了組織中的表達(dá)變化之外，近期的研究表明，miR以高度穩(wěn)定的形式在血清、血漿、尿液和其他體液中檢測到，從而不受內(nèi)源性核糖核酸酶活性的抑制影響[3]。由于miR在外周血表達(dá)穩(wěn)定，可以反映疾病發(fā)生、進(jìn)展和嚴(yán)重程度，加上可以反復(fù)凍融及長期儲(chǔ)存，因此人血漿中miR檢測在心血管疾病中的診斷潛力逐漸成為研究的熱點(diǎn)[4]。研究證實(shí)，miR-210通過缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α參與心肌缺血缺氧反應(yīng)，其活性與線粒體代謝、血管生成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、凋亡細(xì)胞死亡等有關(guān)[5-6]。目前miR-210在AMI病人中的表達(dá)水平及其臨床意義尚不清楚，相關(guān)的研究極少。本研究旨在分析miR-210在AMI病人血漿中的表達(dá)變化，探討miR-210在診斷AMI中作為新的生物標(biāo)志物的潛在作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2015年1月—2016年11月因急性胸痛發(fā)作6 h內(nèi)急診入院，行冠狀動(dòng)脈造影術(shù)，最終確診為AMI的病人65例作為AMI組，不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)病人40例作為UAP組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有胸痛癥狀，發(fā)病在6 h內(nèi)入院；②心電圖、心肌標(biāo)志物或心肌酶譜等指標(biāo)符合2007年美國心臟病學(xué)學(xué)會(huì)(ACC)/美國心臟協(xié)會(huì)(AHA)制定的心肌梗死標(biāo)準(zhǔn)[7]；③冠狀動(dòng)脈造影檢查顯示有1支以上的冠狀動(dòng)脈血管狹窄超過50%；④經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，病人自愿參加，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①因急性創(chuàng)傷、肺栓塞、主動(dòng)脈夾層等引起的胸痛；②合并有肝腎功能不全、心臟瓣膜病、惡性腫瘤等疾病。另選取30名健康體檢者作為對照組，其中，男18例，女12例；年齡51～68(58.2±6.2)歲。

1.2 血漿肌鈣蛋白T(cTnT)檢測 病人在急診入院即刻抽取靜脈血，健康體檢者于清晨空腹采集靜脈血。采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(羅氏公司Elecsys2010)測定cTnT。cTnT>0.5 ng/mL為AMI診斷參考值。

1.3 血漿miR-210檢測 病人采集靜脈血后，加入EDTA抗凝管中，3 000 r/min離心10 min 后分離血漿，隨后以12 000 r/min離心10 min，取上清液置于無RNA酶的EP管中，-80 ℃冰箱保存，集中待測。具體操作步驟：①總RNA抽提。使用TRIzol試劑(Invitrogen)根據(jù)說明書從血清中分離總RNA。通過無RNase水洗滌，收集總RNA，然后使用NanoDrop ND-1000核酸定量檢測儀檢測RNA濃度和純度。②qRT-PCR：按照TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(Ambion)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，定量檢測血漿樣品中miRNA。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的核酸序列設(shè)計(jì)PCR引物。miR-210：上游引物5'-CATGATCAGAGATCAGCCGA-3'；下游引物5'-CTGTGCTGGTGGCATACGTGAT-3'。使用U6作為miR-210表達(dá)的內(nèi)部對照。U6：上游引物5'-CGTAGTCCGTGCTCAGTGGA-3'；下游引物5'-ATACGCTGCTACCTGACCTCAG-3'。采用TaqMan Universal PCR master mix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，qPCR在7300實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系(美國ABI公司)上進(jìn)行，反應(yīng)條件為95 ℃下孵育10 min，隨后40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。使用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料比較 3組年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(BMI)既往病史等基線特征比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組血漿cTnT水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=158.678，P=0.000)，進(jìn)一步兩兩比較，AMI組和UAP組cTnT水平明顯低于對照組(P<0.05)；AMI組cTnT水平明顯低于UAP組(P<0.05)。詳見表1。

2.2 3組血漿miR-210水平比較 3組血漿miR-210水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=102.994，P=0.000)；進(jìn)一步兩兩比較，AMI組和UAP組 miR-210水平明顯高于對照組(均P<0.01)；AMI組miR-210水平明顯高于UAP組(P<0.01)。詳見圖1。

2.3 血漿miR-210與cTnT的相關(guān)性分析 AMI組和UAP組病人miR-210與cTnT水平呈正相關(guān)(r=0.644，P=0.000)。詳見圖2。

表1 3組臨床資料比較

與對照組比較，1)P<0.05；與UAP組比較，2)P<0.05

圖1 3組血漿miR-210水平比較

圖2 血漿miR-210與cTnT的相關(guān)性分析

2.4 血漿miR-210、cTnT對早期診斷AMI的價(jià)值分析 ROC曲線分析miR-210、cTnT早期診斷AMI的價(jià)值，miR-210的ROC曲線下面積(AUC)為0.885[95%CI(0.822～0.949)，P=0.000]，當(dāng)miR-210值為6.0時(shí)，敏感度為78.5%，特異度為92.5%，陽性預(yù)測值94.4%，陰性預(yù)測值72.5%；cTnT的AUC為0.878[95%CI(0.815～0.941)，P=0.000]，當(dāng)cTnT值為0.94時(shí)，敏感度為61.5%，特異度為75.0%，陽性預(yù)測值95.2%，陰性預(yù)測值70.3%；miR-210、cTnT聯(lián)合檢測的AUC值為0.933[95%CI(0.887～0.978)，P=0.000]，靈敏度為96.9%，特異度為93.2%，陽性預(yù)測值95.2%，陰性預(yù)測值82.9%。詳見圖3。

圖3 血漿miR-210、cTnT對早期診斷AMI的ROC曲線分析

3 討 論

miR-210基因位于第11號(hào)染色體短臂的末端(11p15.5)，其靶基因多達(dá)50余個(gè)。miR-210通過調(diào)控這些靶基因的表達(dá)，參與體內(nèi)各種生理與病理代謝過程[8]。研究證實(shí)，miR-210參與了多種心血管疾病的生理和病理過程[9]。Bostjancic等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生AMI后，miR-210相對表達(dá)水平增高。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，活血化瘀方劑可有效減少大鼠AMI面積，改善間質(zhì)纖維化及心功能，這些作用可能與通過miR-210及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)心肌血管生成有關(guān)。miRNA在細(xì)胞中對缺氧和缺血性心血管疾病反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，表明microRNA是一類新興的治療靶點(diǎn)[12]。

缺氧是缺血性心血管疾病的關(guān)鍵致病因素。內(nèi)皮及心肌組織在細(xì)胞缺氧損傷期間，miR-210水平明顯增加。血漿miR-210可能來源于缺血壞死的心肌及內(nèi)皮細(xì)胞。其機(jī)制可能是缺氧刺激心肌細(xì)胞系，通過低氧誘導(dǎo)因子α1刺激miR-210產(chǎn)生增多，從而釋放入血，導(dǎo)致血漿水平明顯增高[13]。miR-210可以通過促進(jìn)血管生成來改善心臟功能并抑制細(xì)胞凋亡，提示通過相關(guān)載體遞送miR-210具有治療缺血性心臟病的治療潛力。目前有關(guān)miR-210在AMI病人血漿中的表達(dá)水平及其診斷價(jià)值相關(guān)的報(bào)道極少。本研究結(jié)果顯示，血漿miR-210在AMI及UAP病人中相對表達(dá)水平明顯高于健康對照者，AMI組miR-210水平明顯高于UAP組。提示血漿miR-210有可能是心肌梗死診斷的潛在生物標(biāo)志物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AMI和UAP病人miR-210與cTnT水平呈正相關(guān)，ROC曲線分析顯示，miR-210、cTnT的AUC值分別為0.885、0.878，根據(jù)Swets的診斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)AUC在0.7～0.9時(shí)，ROC曲線更準(zhǔn)確，AUC>0.9表示高準(zhǔn)確率。因此，與AMI經(jīng)典診斷指標(biāo)cTnT相比，miR-210具有相似的診斷AMI能力。此外，miR-210與cTnT對AMI的診斷均有較高的敏感度和特異性，對于AMI具有可靠的診斷價(jià)值，兩者聯(lián)合檢測其AUC值為0.933，其靈敏度和特異性均高于單一指標(biāo)，因此，聯(lián)合檢測miR-210和cTnT，有助于更為準(zhǔn)確地早期診斷AMI。miR-210可能是AMI早期診斷潛在的新型生物標(biāo)志物。

miR-210具有早期診斷AMI的潛在價(jià)值。但miR-210是否能作為AMI診斷的生物標(biāo)志物，取決于分析準(zhǔn)確性和重復(fù)性、快捷性，這是確定AMI生物標(biāo)志物是否具有臨床潛力時(shí)的關(guān)鍵因素。本研究也存在一些不足之處：①研究納入的樣本量偏少且為單中心研究，在一定程度上對結(jié)果造成偏倚。②缺乏對AMI發(fā)病過程中miR-210水平的波動(dòng)變化觀察。將急性胸痛發(fā)作6 h以內(nèi)的病人納入研究對象，基于心肌缺血早期階段(6 h)，miR水平增高。而對于發(fā)病6 h以后的病人沒有進(jìn)一步檢測miR-210。而作為經(jīng)典診斷指標(biāo)血清cTnT通常在3～6 h開始升高，發(fā)病后3～4 d和11～14 d恢復(fù)至正常水平[14]。因此連續(xù)監(jiān)測血漿miR-210的變化在大多數(shù)急性胸痛病人盡快明確AMI診斷是極為必要的，這對于評(píng)估m(xù)iR-210作為AMI診斷標(biāo)志物是不可或缺的。后續(xù)的工作將對AMI病人在不同時(shí)間段進(jìn)行miR-210檢測，以期了解miR-210在AMI發(fā)病過程中的變化及其預(yù)后價(jià)值。

綜上所述，AMI病人血漿miR-210表達(dá)水平明顯增高，與cTnT水平呈正相關(guān)，可能是早期診斷AMI新的生物標(biāo)志物，但其潛在價(jià)值還有待于更多的研究加以闡明。