張瑜

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著近年來地球氣候變暖森林腦炎在有不斷擴(kuò)大流行的趨勢，目前，森林腦炎的治療藥物主要有地塞米松、利巴韋林和干擾素等，這些藥物雖都有抗菌消炎的作用，但如果長期、大劑量應(yīng)用，則會引起各種不良反應(yīng)和停藥反應(yīng)[1]。有研究表明，復(fù)方中藥對森林腦炎具有良好的治療效果，但其治療機(jī)制還不明確[2]。因此，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)臨床經(jīng)驗(yàn)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究成果，選擇苦參、訶子、川楝子、梔子、紫花地丁等中藥組方對感染森林腦炎病毒的小鼠進(jìn)行治療，對其腦組織中炎性因子的含量進(jìn)行測定，并對腦組織中介導(dǎo)炎性反應(yīng)的TLR/TRIF信號通路中相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，對復(fù)方中藥是如何降低炎癥損傷，發(fā)揮其對腦組織的保護(hù)作用的途徑和機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 病毒液的制作和收集

將森林腦炎病毒液加入地鼠腎傳代細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入病毒液后慢慢晃動混勻，保證病毒液充分接觸并感染細(xì)胞后，將培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)90 min。每天觀察細(xì)胞，當(dāng)超過90%細(xì)胞病變并有細(xì)胞脫落時(shí)收獲細(xì)胞病毒液，然后反復(fù)在-80℃、-37℃條件下反復(fù)凍融細(xì)胞，充分釋放病毒于細(xì)胞培養(yǎng)液中，無菌條件下1 000 rpm，離心10 min，收集上清液，分裝備用。

1.1.2 感染小鼠模型的制作

選取清潔級21日齡雄性小鼠，體質(zhì)量(18±1)g，制作模型前禁食12 h，禁水6 h。將小鼠麻醉后，在小鼠眼后角、耳前緣、顱中線所構(gòu)成的三角形中點(diǎn)部位，將微量注射器抽取好的病毒懸液20 μL垂直進(jìn)針3～5 mm，將病毒液緩慢推進(jìn)鼠腦，注毒結(jié)束后待病毒液完全吸收后再快速將針頭拔出，以免未被腦組織完全吸收的病毒液流出。采用RT-PCR技術(shù)檢測實(shí)驗(yàn)小鼠血清中森林腦炎病毒的RNA片段，以鑒定動物模型制作的成功。

1.1.3 復(fù)合中藥

復(fù)合中藥由苦參、訶子、川楝子、梔子、紫花地丁等5味藥材飲片由黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)提供，經(jīng)50℃烘干、粉碎后過40目篩制成原粉?？鄥?、訶子、川楝子、梔子、紫花地丁原粉按4∶2∶2∶2∶1的比例組方，加水煎煮2次，每次煎煮90 min，取過濾后藥汁混合，濃縮藥汁,使1 mL的藥液相當(dāng)于1 g的藥粉，以濃縮藥汁為實(shí)驗(yàn)藥液。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組

選取12只健康小鼠作為空白組，另選取48只模型小鼠隨機(jī)分為模型組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組、每組各12只。各組具體處理方法如下,空白組：動物正常飼養(yǎng)，顱內(nèi)注入與病毒液等量的生理鹽水,觀察期內(nèi)予與中藥藥液等量的蒸餾水灌胃；模型組：動物接受森林腦炎病毒感染腦組織模型的制備，觀察期內(nèi)予與中藥藥液等量的蒸餾水灌胃；高劑量組：動物接受森林腦炎病毒感染腦組織模型的制備12 h后按1.56 g/kg劑量給予灌胃治療，每日2次；中劑量組：動物接受森林腦炎病毒感染腦組織模型的制備12 h后按0.78 g/kg劑量給予灌胃治療，每日2次；低劑量組：動物接受森林腦炎病毒感染腦組織模型的制備12 h后按0.39 g/kg劑量給予灌胃治療，每日2次。動物飼養(yǎng)于人工控制條件下，小鼠同室、分籠飼養(yǎng)，每籠6只。室溫控制在20～23℃，相對濕度為50%～60%，每12 h光照/黑暗循環(huán)，小鼠可自由進(jìn)食、進(jìn)水，保持墊料清潔干燥，實(shí)驗(yàn)期為7 d。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

實(shí)驗(yàn)第4 d和7 d，每組選擇5只小鼠麻醉后，斷頭取腦，剝離腦組織，取右側(cè)大腦半球置入凍存管中并迅速投入-80℃冰箱備存，其中一半用于組織勻漿采用ELISA方法檢測腦組織中TLR-2、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子含量，另一半提取總RNA用于熒光定量PCR檢測大鼠腦組織TLR-2、TRIF、NF-κB、MyD88和TRAF6等基因的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)方法按試劑盒說明書操作進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中藥對小鼠腦組織中炎性因子含量的影響

小鼠腦組織中炎性因子的檢測結(jié)果見表1。在實(shí)驗(yàn)第4 d和7 d，模型組和各治療組小鼠腦組織中的TLR-2含量顯著高于空白組(P<0.05)；在實(shí)驗(yàn)第4 d和7 d，模型組、低劑量組小鼠腦組織中的TLR-2含量顯著高于中、高劑量組(P<0.05)。

表1 復(fù)方中藥對小鼠腦組織中炎性因子含量的影響

注：與空白組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05

在實(shí)驗(yàn)第4 d和7 d，模型組和各治療組小鼠腦組織中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著高于空白組(P<0.05)；在實(shí)驗(yàn)第4 d和7 d，模型組、低劑量組小鼠腦組織中的IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著高于中、高劑量組(P<0.05)。

2.2 復(fù)方中藥對小鼠腦組織TRIF/NF-κB信號通路基因表達(dá)的影響

復(fù)方中藥對小鼠腦組織TRIF/NF-κB信號通路基因表達(dá)的影響見表2。在實(shí)驗(yàn)第4 d和7 d，模型組和各治療組小鼠腦組織中的TLR-2基因表達(dá)量顯著高于空白組(P<0.05)；在實(shí)驗(yàn)第4 d和7 d，模型組、低劑量組小鼠腦組織中的TLR-2基因表達(dá)量顯著高于中、高劑量組(P<0.05)。

在實(shí)驗(yàn)第4 d和7 d，模型組和各治療組小鼠腦組織中TRIF、NF-κB、MyD88和TRAF6基因表達(dá)量顯著高于空白組(P<0.05)；在實(shí)驗(yàn)第4 d和7 d，模型組、低劑量組小鼠腦組織中TRIF和NF-κB基因表達(dá)量顯著高于中、高劑量組(P<0.05)。

3 討論

森林腦炎病毒感染腦組織后所引起的神經(jīng)損傷是由多種不同因素共同參與的，其病理過程極其復(fù)雜。近年來，對急性免疫所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對腦組織造成的繼發(fā)性損傷越來越受到臨床研究重視。有研究指出，腦在感染病毒后會引起組織的中性粒細(xì)胞的滲出、浸潤，進(jìn)而釋放出不同類型的炎性細(xì)胞因子，同時(shí)也會引起腦組織中微血管循環(huán)的阻塞，從而造成病灶局部的腦缺血。有研究證明，患有腦炎的幼兒的腦脊液中，IL-6會出現(xiàn)過度高表達(dá)的現(xiàn)象，導(dǎo)致患者出現(xiàn)細(xì)胞毒性腦水腫，并伴隨神經(jīng)細(xì)胞的損傷，而且這種IL-6高表達(dá)與神經(jīng)功能缺損程度呈正相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，腦中的IL-6可以通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)對腦細(xì)胞造成損害，而且補(bǔ)體系統(tǒng)被激活后，還會產(chǎn)生大量過敏毒素并進(jìn)一步刺激TNF-α的分泌，從而激活并增加腦細(xì)胞中黏附分子的表達(dá)，并釋放相關(guān)的蛋白酶和氧化酶，導(dǎo)致腦組織的繼發(fā)性損害的加劇[3]。有研究表明， IL-1β、IL-6等炎性因子會先后釋放到動物的腦組織中，而這些炎性因子會對血腦屏障造成破壞，增強(qiáng)血腦屏障的通透性，從而介導(dǎo)了腦組織發(fā)生急性免疫的炎癥損傷，加重腦組織的損害，并進(jìn)一步加重神經(jīng)細(xì)胞的變性、壞死情況；而減弱IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子的活性，動物腦組織的損傷程度也隨之減輕[4]。研究表明，TNF-α等炎性因子通過增強(qiáng)腦組織內(nèi)皮細(xì)胞中NO的毒性來對血腦屏障進(jìn)行破壞，動物感染病毒性腦炎后，TNF-α可以通過激活信號通路引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞甚至膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，而且TNF-α的大量分泌引起的鈣超載和自由基的過量產(chǎn)生也可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[5]。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過中、高劑量治療后，感染森林腦炎病毒的小鼠腦組織中的炎性因子含量顯著降低，說明復(fù)方中藥可以有效降低感染小鼠腦組織的炎性反應(yīng)，減輕腦組織損傷。

表2 復(fù)方中藥對小鼠腦組織TRIF/NF-κB信號通路基因表達(dá)的影響

注：與空白組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P<0.05

目前，Toll樣受體(TLR)家族被認(rèn)為是哺乳動物體內(nèi)唯一能夠識別細(xì)胞外抗原信息，并將該信息向細(xì)胞內(nèi)傳遞，從而引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白家族。TLR家族的其他功能還包括調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，促進(jìn)免疫細(xì)胞表達(dá)相關(guān)免疫分子等。TLR-2是模式識別受體中的一種，主要分布在細(xì)胞表面，可以識別病毒病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，在病毒入侵機(jī)體的早期即啟動固有免疫，其主要作用是促進(jìn)細(xì)胞炎性因子的產(chǎn)生[6]。TLR-2特異性識別病毒PAMPs結(jié)構(gòu)后，促使相關(guān)激活細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并進(jìn)一步介導(dǎo)多種快速反應(yīng)基因的活化，表達(dá)炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和共刺激分子免疫細(xì)胞因子等，參與機(jī)體對抗原的防御反應(yīng)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。TLR-2的信號傳導(dǎo)包括兩條途徑：即髓樣分化因子(MyD88)的依賴和非依賴途徑，MyD88途徑被認(rèn)為是TLR-2信號傳導(dǎo)的主要通路。TLR-2識別配體后，主要通過TRIF途徑活化NF-κB等誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞釋放炎性因子并介導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，對病毒產(chǎn)生天然免疫。因此，NF-κB是重要的炎癥調(diào)控因子，它通過誘導(dǎo)激酶激活I(lǐng)κB家族中的α、β激酶，使IκB磷酸化降解。NF-κB除了調(diào)控多種炎癥因子外，還是一種能夠?qū)⒓?xì)胞核內(nèi)外信息雙向傳遞的的多向性轉(zhuǎn)錄因子。該功能使NF-κB 被激活后能夠進(jìn)入核內(nèi)進(jìn)一步調(diào)控TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等多種炎癥因子的靶基因轉(zhuǎn)錄。因此，正常細(xì)胞中只需要有少量的NF-κB表達(dá)，而如果細(xì)胞過量NF-κB表達(dá)會給機(jī)體組織造成損傷[7]。研究證實(shí)，NF-κB 可以誘導(dǎo)多種神經(jīng)毒性物質(zhì)表達(dá)以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，尤其在病毒性腦炎的腦組織繼發(fā)性損害中起重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR-2活化后能誘導(dǎo)細(xì)胞損傷, 活化的TLR-2可以通過內(nèi)源性和外源性兩條途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，并破壞體內(nèi)的血管屏障引起病毒擴(kuò)散，從而加速疾病的惡化進(jìn)程[9]。臨床研究表明，TLR-2是森林腦炎病毒感染并加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的危險(xiǎn)因素之一，森林腦炎病毒可引起動物腦組織中NF-kB蛋白水平和mRNA水平顯著的升高，這一變化加重了腦炎的炎癥反應(yīng)，會對預(yù)后產(chǎn)生不利影響[10]。由此可見，在感染森林腦炎病毒后，動物腦組織細(xì)胞中的TLR/TRIF信號通路是重要的炎性介導(dǎo)途徑，該信號通路通過激活下游炎癥信號使下游炎性因子過度表達(dá)，誘發(fā)級聯(lián)式炎癥反應(yīng)，加重森林腦炎向不良方向轉(zhuǎn)變[10]。本實(shí)驗(yàn)熒光定量 PCR結(jié)果顯示，雖然經(jīng)過治療后，感染森林腦炎病毒小鼠TLR-2、TRIF、NF-κB、MyD88和TRAF6依然要顯著高于空白組，但是中、高劑量的藥物治療組顯著低于對照組，再結(jié)合中、高劑量組小鼠腦組織中的炎性因子也顯著低于模型組，說明復(fù)方中藥可以通過抑制TLR/TRIF信號通路蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制感染森林腦炎病毒小鼠的炎癥反應(yīng)。

4 結(jié)論

綜上所述，通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中藥可以通過降低TLR/TRIF信號通路上TLR-2的表達(dá)，進(jìn)一步抑制該通路下游的TRIF、NF-κB、MyD88和TRAF6蛋白的表達(dá)，從而抑制森林腦炎病毒感染小鼠腦組織中TLR-2誘導(dǎo)的炎性級聯(lián)反應(yīng)，降低森林腦炎病毒感染引起的腦組織急性免疫介導(dǎo)的炎癥損害，保護(hù)腦組織不會受到炎癥反應(yīng)繼發(fā)性損傷，為臨床治療森林腦炎提供了新的、有效的治療手段。