陳波,金錦玉,周亞濱,張琪,于曉紅,徐京育,張雪松,宋雪,張瑜,牛雯穎

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.哈爾濱市穆斯林醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

心律失?？煞譃榭焖傩院途徛詢煞N，快速性主要以早搏、心動(dòng)過(guò)速、房顫、房速、室速及室顫等居多，是心血管疾病中重要的疾病。本實(shí)驗(yàn)以復(fù)方中藥早搏靈為實(shí)驗(yàn)藥物，前期觀察，早搏靈能夠改善患者臨床癥狀，對(duì)早搏有抑制作用，為進(jìn)一步觀察作用機(jī)理，以氯化鋇誘導(dǎo)快速性心律失常大鼠，觀察早搏靈對(duì)T型鈣離子鈣離子通道α1H亞基表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取清潔級(jí)Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量(227.51±6.44)g，選取的動(dòng)物由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(黑)2013-001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

早搏靈膠囊由紅參10 g,當(dāng)歸15 g,黃芪20 g,山楂15 g,麥冬15 g,青皮15 g,黃芩15 g,苦參15 g,丹參15 g,等組成，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室制備，黑藥制字Z20110063，批號(hào)：20170324；鹽酸維拉帕米片,批號(hào)：161001，天津市中央藥業(yè)有限公司。氯化鋇(分析純),批號(hào)：20160401，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；水合氯醛(分析純),批號(hào)：20151215，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；生理鹽水,批號(hào)161104D12，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

十六導(dǎo)生理記錄儀MP150(BIOPAC Systems,Inc.),熒光定量PCR儀(美國(guó)bio-rad公司),BECKMAN低溫超速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司),TGL-16G型高速臺(tái)式離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組及給藥方法

選用健康大鼠40只,隨機(jī)分4組,維拉帕米對(duì)照組，生理鹽水組,早搏靈膠囊組，模型組,每組10只，每日灌胃給藥1次，連續(xù)1周。模型組、空白組予以生理鹽水10 mL/kg灌服 ；中藥防治組予34.6 mg/mL的早搏靈溶液10 mL/kg灌服 ；對(duì)照組予以3.32 mg/mL的維拉帕米溶液10 mL/kg灌服。末次給藥1 h后，記錄正常心電圖，然后用5%水合氯醛(10 mg/kg)腹腔注射麻醉后,再經(jīng)大鼠舌下靜脈注射氯化鋇(8 mg/kg)，同時(shí)描記大鼠心電圖變化，包括注射后0 min，1 min,3 min,5 min,10 min,20 min，間隔10 min進(jìn)行一次記錄，至心電圖和心率回復(fù)正常。氯化鋇造模后，大鼠出現(xiàn)不同程度的惡性心律失常。心電觀察完畢后，取心肌組織，液氮凍存后置于-80℃冰箱保存。采用熒光定量實(shí)時(shí)PCR技術(shù)觀察心肌組織鈣通道基因α1H的變化。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光PCR條件及方法

采用總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取組織中總mRNA，經(jīng)過(guò)紫外分光光度計(jì)，檢測(cè)OD260/OD280，計(jì)算RNA的濃度與純度。用cDNA試劑盒(transgen)將5 μg的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以2 μL的cDNA為模板，利用針對(duì)α1H設(shè)計(jì)的引物(正向5′-AAGATGAGCCCTCCCTGCAT-3′；反向5′-GTAGTGTTGCCTCCTTCGGC-3′)、Kir2.1設(shè)計(jì)的引物(正向5′-TCGATAGCGGAATCGACCGT-3′；反向5′-ATGAACTCCGGCATTGCGTT-3′)和SCN5設(shè)計(jì)的引物(正向5′-CCAGAGTGCCAGGAATCAGC-3′；反向5′-GGCCTTCATGTCCGCTATGG-3′)，PCR擴(kuò)增特異性片段。PCR的反應(yīng)條件如下：a:95℃ for 1 min,b:95℃ for 0:10,c:60℃ for 30 s(+Plate Read),d:Go To b 39 more times,e:Melt Curve 65 to 95℃,increment 0.5℃ for 5 s(+Plate Read)，針對(duì)GAPDH的PCR產(chǎn)物作為平行參照(GAPDH:正向引物5′-AGCTTCGGCACATATTTCATCTG-3′；反向引物5′-CGTTCACTCCCATGACAAACA-3′)。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 早搏靈膠囊對(duì)大鼠心律失常持續(xù)時(shí)間的影響 見(jiàn)表1

表1 氯化鋇造模后大鼠心律失常持續(xù)時(shí)間的比較

注：與模型組比較，*P<0. 05

給予灌胃給藥相應(yīng)計(jì)量氯化鋇后，生理鹽水組沒(méi)有一例發(fā)生快速性心律失常。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析后顯示:早搏靈膠囊組、模型組與維拉帕米組經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)性。三組快速性心律失常持續(xù)時(shí)間經(jīng)單因素方差分析，具有極顯著性差異(P<0.01)。在此之后行LSD-t檢驗(yàn)，其中模型組與維拉帕米組、模型組與早搏靈組與比較，心律失常持續(xù)時(shí)間均縮短，有顯著差異性(P<0.01);早搏靈組與維拉帕米組比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，證明兩者均可降低心律失常持續(xù)時(shí)間，因此不能證明兩者在心律失常持續(xù)時(shí)間的影響上有差異。

2.2 各組大鼠鈣離子通道α1H亞基表達(dá)結(jié)果

表2 各組大鼠鈣離子通道α1H亞基表達(dá)結(jié)果

注：基因差異表達(dá)倍數(shù)>1為高表達(dá)，<1為低表達(dá)；<0.5或>2為有顯著性

從表2中看出，經(jīng)大鼠舌下靜脈注射氯化鋇，當(dāng)大鼠出現(xiàn)快速性心律失常后，早搏靈膠囊組與模型組相比，T型鈣通道α1H亞基為低表達(dá)，有顯著性差異，證明早搏靈膠囊對(duì)T型鈣通道α1H亞基表達(dá)有抑制作用；維拉帕米組T型鈣通道α1H亞基為高表達(dá)，說(shuō)明維拉帕米對(duì)T型鈣通道α1H亞基表達(dá)無(wú)明顯抑制作用。

3 討論

早搏靈膠囊具有益氣養(yǎng)陰、理氣活血之功效。早搏靈膠囊方中以紅參為君藥，長(zhǎng)于大補(bǔ)元?dú)猓帜馨采裆?。臣藥有黃芪、當(dāng)歸、丹參。黃芪是補(bǔ)氣之要藥，與紅參相配伍，令氣旺血行，達(dá)到瘀去絡(luò)通作用。麥冬具有生津養(yǎng)陰、清心除煩之功,與紅參相伍益氣養(yǎng)陰復(fù)脈是生脈,散主藥。當(dāng)歸補(bǔ)血養(yǎng)血又活血,山楂行氣散結(jié)。丹參祛瘀止痛，又有安神養(yǎng)心定志作用。青皮為佐藥行氣活血。黃芩、苦參清熱防藥物過(guò)于滋膩?，F(xiàn)有藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，早搏靈膠囊中黃芪、當(dāng)歸等可以作用于鈣離子通道，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，心肌細(xì)胞膜上的Ca2+內(nèi)流減少，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載的現(xiàn)象降低，心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)得到穩(wěn)定，保護(hù)心肌，從而心肌組織傳導(dǎo)性得到改善，可以對(duì)抗各種原因引起的快速性心律失常[1-2]。

氯化鋇造模，誘發(fā)大鼠出現(xiàn)快速心律失常，具有多樣性和復(fù)雜性的特點(diǎn)，其作用原理是氯化鋇可以抑制鈉-鉀泵，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉高鉀低，同時(shí)因鈉-鈣交換，使細(xì)胞內(nèi)鈣超載，鈣過(guò)量的結(jié)果可誘發(fā)快速性心律失常[3]。現(xiàn)代研究表明，通過(guò)調(diào)控鈣離子通道，可有效治療快速性心率失常[4]。鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，主要有兩種方式，分別是化學(xué)門(mén)控式和電壓門(mén)控式。在血管平滑肌中主要的電壓門(mén)控式鈣通道分為L(zhǎng)型和T型兩種電壓門(mén)控式鈣通道。T型鈣通道可參與心臟的起搏活動(dòng)，如果T型鈣通道被完全阻斷心臟起搏活動(dòng)就可以減慢20%。研究發(fā)現(xiàn)，心房起搏細(xì)胞上的T型鈣流比非起搏細(xì)胞要大,當(dāng)阻斷T型鈣流，可以減慢心率，達(dá)到控制快速心律失常作用[5]。近年來(lái)的研究多支持 T 型鈣通道功能的異常與心血管疾病有密切聯(lián)系。T型鈣通道具有快激活、快失活、慢去活、單通道電容小，以及低電壓激活(-60 mV)的特性，因此被稱為低電壓激活鈣離子通道。T型鈣離子通道在心臟心肌傳導(dǎo)組織、動(dòng)脈血管壁上、以及神經(jīng)激素釋放的部位中含量較高, 因此在興奮傳導(dǎo)電流時(shí)生理病理意義非常重要[6]。在脊椎動(dòng)物中，T 型鈣離子通道包括3個(gè)不同的α1亞基基因: CACNA1G、CACNA1H、CACAN1I，分別編碼 α1G、α1H、和α1I[7]。每個(gè)α1亞單位在膜電位發(fā)生變化時(shí)可以控制通道的開(kāi)放和關(guān)閉[8]。在某些病理狀態(tài)下的心臟疾病中，T型鈣通道可以阻斷鈣離子由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)的過(guò)多內(nèi)流，而參與細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)控，從而減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子過(guò)多的現(xiàn)象，減少心律失常的發(fā)生[9]。近兩年有研究，同樣發(fā)現(xiàn)心律失常的原因可能與心室肌T型鈣通道表達(dá)增多有關(guān)[10]。T型鈣通道在心肌癥狀發(fā)展過(guò)程中可能對(duì)心肌細(xì)胞的重塑起重要作用[11]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，比較心肌組織T型鈣通道α1H亞基表達(dá)水平，早搏靈組T型鈣通道α1H亞基與模型組比較顯著低表達(dá)。早搏靈組與維拉帕米組相比較，早搏靈組心肌組織T型鈣通道α1H亞基表達(dá)水平下調(diào)，而維拉帕米組與模型組無(wú)差異性，說(shuō)明在T型鈣離子通道α1H亞基拮抗作用方面，早搏靈膠囊優(yōu)于維拉帕米。早搏靈作用機(jī)制可能是下調(diào)T型鈣離子通道α1H亞基表達(dá)，減少病理狀態(tài)下心肌組織內(nèi)Ca2+過(guò)多內(nèi)流，從而減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載狀態(tài)。這可能是其治療快速性心律失常的機(jī)制之一[12]。

4 結(jié)語(yǔ)

當(dāng)今，心血管疾病已嚴(yán)重危害人們身體健康，特別高發(fā)于中老年人群，具有患病率高、致殘率高和死亡率高的特點(diǎn)，快速心律失常持續(xù)發(fā)作如果治療不及時(shí)，最終結(jié)果可導(dǎo)致病人猝死。在今后的研究實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該更深入、更全面地掌握中藥抗心律失常的作用機(jī)制，在臨床實(shí)踐中進(jìn)行更大樣本、更細(xì)致的研究，使中醫(yī)藥在治療快速型心律失常方面的水平得到進(jìn)一步提高。