喬海琦 閆琳 余洋 常智 王佳玲 裴延敏 周茹

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.07

摘 要 目的：研究氧化槐果堿（OSC）對離體大鼠胸主動脈環(huán)的舒張作用及其機制。方法：取大鼠胸主動脈環(huán)（簡稱“血管環(huán)”），以舒張率為指標，以K-H營養(yǎng)液為空白對照，分別考察不同質量濃度的OSC（0.2～1.0 mg/mL）對基礎狀態(tài)的正常血管環(huán)，以及經去甲腎上腺素（PE，1×10-6 mol/L）預收縮的正常或去內皮血管環(huán)的舒張作用;分別以一氧化氮合酶抑制劑L-硝基精氨酸甲酯（L-NAME）、環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛（INDO）預孵育大鼠正常胸主動脈環(huán)，以4種鉀通道阻滯劑[氯化鋇（BaCl2）、四乙基胺（TEA）、4-氨基吡啶（4-AP）、格列本脲（Gli）]預孵育去內皮血管環(huán)，同法考察不同質量濃度的OSC（0.2～1.0 mg/mL）對上述血管環(huán)的舒張作用。結果：與空白對照比較，不同質量濃度的OSC對基礎狀態(tài)的正常血管環(huán)的舒張率無顯著影響（P>0.05），但0.4～1.0 mg/mL的OSC能顯著提高經PE預收縮的正?；蛉绕ぱ墉h(huán)的舒張率（P<0.01），且呈濃度依賴趨勢。經L-NAME、INDO、4-AP、BaCl2預孵育后，不同質量濃度的OSC對經PE預收縮的正?；蛉绕ぱ墉h(huán)的舒張率均無顯著影響（P>0.05）;而經TEA、Gli預孵育后，0.4～1.0 mg/mL的OSC可顯著降低經PE預收縮的去內皮血管環(huán)的舒張率（P<0.01）。結論：OSC在試驗劑量（0.2～1.0 mg/mL）范圍內對基礎狀態(tài)的大鼠胸主動脈環(huán)無明顯舒張作用，但0.4～1.0 mg/mL的OSC對經PE預收縮的正常或去內皮大鼠胸主動脈環(huán)均有明顯舒張作用;其血管舒張的作用機制為非內皮依賴性，可能與受體操縱性鈣通道、鈣激活鉀通道和ATP敏感鉀通道有關。

關鍵詞 氧化槐果堿;胸主動脈環(huán);血管舒張;內皮依賴性;鉀通道;鈣通道;機制

Study on Vasodilatory Effect of Oxysophocarpine on Isolated Thoracic Aortic Rings of Rats and Its Mechanism

QIAO Haiqi1，YAN Lin1，YU Yang1，CHANG Zhi1，WANG Jialing1，PEI Yanmin1，ZHOU Ru1，2，3（1. School of Pharmacy， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China; 2. Ningxia Modernization Engineering Technology Research Center for Hui Medicine and Ningxia Collaborative Innovation Center of Ningxia Medical University， Yinchuan 750001， China; 3. Modernization Key Laboratory for Hui Medicine Co-founded by Ningxia Hui Autonomous Region and Ministry of Education， Ningxia Medical University， Yinchuan 750001， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the vasodilatory effect of oxysophocarpine （OSC） on isolated thoracic aortic rings of rats and its possible mechanism. METHODS： Thoracic aortic rings of rats were collected （called “vascular ring” for short）. Using K-H nutrient solution as blank control and the diastolic rate as index， the effects of different concentrations （0.2-1.0 mg/mL） of OSC on normal vascular rings in basal state， normal or endothelium-free vascular rings pre-contracted by norepinephrine （PE， 1×10-6 mol/L） were investigated. After pre-culturing normal thoracic aortic rings by nitric oxide synthase inhibitor L-nitro-arginine methyl ester（L-NAME）and cyclooxygenase inhibitor indomethacin（INDO），as well as pre-culturing endothelium-free vascular rings by potassium ion channel blocker BaCl2，tetraethylammonium（TEA）and 4-aminopyridine（4-AP）， the diastolic effects of OSC of different concentrations （0.2-1.0 mg/mL） on the above vascular rings were investigated by using the same method. RESULTS： Compared with blank control， there was no significant effects of different concentrations of OSC on the diastolic rate of normal vascular rings in basal state （P>0.05）， but 0.4-1.0 mg/mL OSC could significantly improve the diastolic rate of normal or endothelium-free vascular rings pre-contracted by PE （P<0.01）， in concentration-dependent manner. After preculturing with L-NAME， INDO， 4-AP and BaCl2， different concentrations of OSC had no significant effect on the diastolic rate of normal or endothelium-free vascular rings pre-contracted by PE （P>0.05）. After pre-culturing with TEA and Gli， 0.4-1.0 mg/mL OSC could significantly reduce the diastolic rate of endothelium-free vas- cular rings pre-contracted by PE （P<0.01）. CONCLUSIONS： OSC did not significantly dilate the thoracic aortic rings of rats in the basal state within the dose range （0.2-1.0 mg/mL）， but OSC of 0.4-1.0 mg/mL have significant diastolic effects on the normal or endothelium-free thoracic aortic rings of rats pre-contracted with PE. The mechanism of thoracic aortic rings dilation is endothelium-independent， which may be associated with receptor operational calcium channel，Ca2+-activated potassium channels and ATP-sensitive potassium channels.

KEYWORDS ? Oxysophocarpine; Thoracic aortic rings; Vasodilation; Endothelium independent;Potassium channel; Calcium channel; Mechanism

苦豆子（Sophora alopecuroides Linn.）是豆科槐屬多年生草本或基部木質化植物，俗稱西豆根、苦甘草、布亞（維吾爾名）、胡蘭-寶雅（蒙古名）等[1]，是寧夏特色藥用植物，主要含有苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿（Oxysophocarpine，OSC）、槐定堿、苦豆堿等生物堿[2]。研究表明，苦豆子生物堿在抗病毒、抗腫瘤、抗炎等方面具有重要的藥理活性，在心血管系統(tǒng)、中樞神經系統(tǒng)有良好的應用前景[2]。其中，苦參堿可拮抗苯腎上腺素對豚鼠主動脈環(huán)的收縮作用[3]，苦豆堿可拮抗去甲腎上腺素對大鼠主動脈環(huán)的收縮作用[4]，這為此類生物堿用于高血壓等相關疾病的治療奠定了基礎。OSC作為苦豆子中分離的一種含量較高的生物堿[5]，已有研究發(fā)現其對炎癥和非炎癥所致的疼痛反應均具有明顯的抑制作用[6]。然而，OSC是否和苦豆子中如苦參堿、苦豆堿等生物堿一樣具有舒張血管環(huán)的作用尚未見報道。因此，本研究采用離體血管環(huán)灌流方法，考察OSC對離體大鼠胸主動脈環(huán)的舒張作用并探討其作用機制，為篩選植物來源的心腦血管疾病治療藥物提供實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

HV-4型離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）;JZ-100型肌張力換能器（北京新航興業(yè)科貿有限公司）;Powerlab型生物信號采集分析系統(tǒng)（寧夏醫(yī)科大學藥理實驗室）;HH-S24 型超級恒溫水浴鍋（菏澤大華儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

OSC原料藥（批號：071218，純度：98%）、氯化鋇（BaCl2，批號：X11J10J79704）均購自上海源葉生物科技有限公司;氯化乙酰膽堿（Ach，北京索萊寶科技有限公司，批號：601H013）;苯腎上腺素（PE，上海和豐藥業(yè)有限公司，批號：07150801）;L-硝基精氨酸甲酯（L-NAME，批號：120373）、格列本脲（Gli，批號：131426）均購自上海易恩化學技術有限公司）;吲哚美辛（INDO，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：C1723020）;4-氨基吡啶（4-AP，東京化成工業(yè)株式社會，批號：RWZZC-NC）;四乙基銨（TEA，上海畢得醫(yī)藥科技有限公司，批號：ASU324）;其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

K-H營養(yǎng)液為本課題組臨用時自制（取NaCl 6.92 g、KCl 0.35 g、NaHCO3 2.21 g、CaCl2·2H2O 0.28 g、KH2PO4 0.16 g、MgSO4·7H2O 0.29 g、葡萄糖2.0 g，加水1 L溶解后，用NaOH溶液調節(jié)pH為7.4），置于37 ℃的恒溫水浴中保存，備用。

1.3 動物

SPF級SD大鼠60只，雄性，體質量為220～320 g，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物生產合格證號：SCXK（寧）2015-0001。動物飼養(yǎng)于環(huán)境溫度、濕度適宜的環(huán)境中，自由進食飲水。本實驗方案經寧夏醫(yī)科大學倫理審查委員會審核通過（批準號：寧醫(yī)大倫理第2016-033號）。

2 方法

2.1 胸主動脈環(huán)的制備

大鼠用10%烏拉坦腹腔注射麻醉后，于胸部正中切開，分離胸主動脈，迅速移入通有 95%O2和5%CO2混合氣體的K-H營養(yǎng)液中，立即清除血污，并小心剔除血管周圍的脂肪和結締組織。將血管剪成 3～4 mm長的血管環(huán)，懸掛于離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)的浴槽（37 ℃預熱，容量為20 mL）內，一端用M型鉤固定，另一端通過肌張力換能器連接生物信號采集分析系統(tǒng)并調節(jié)靜息張力為2.0 g，持續(xù)通以95%O2和5%CO2混合氣體，每20 min 更換K-H營養(yǎng)液1次，在37 ℃下穩(wěn)定60 min[7]。加入4 mol/L KCl溶液0.1 mL至浴槽，使血管環(huán)收縮達峰值后，以K-H營養(yǎng)液沖洗，重復上述操作3次，以誘發(fā)血管環(huán)達到最大收縮幅度后，可用于后續(xù)試驗;同時，采用肌張力轉換器檢測并記錄血管環(huán)最大收縮幅度。

2.2 去內皮胸主動脈環(huán)的制備

取“2.1”項下血管環(huán)（經KCl處理，下同），用與血管環(huán)內徑相適應的棉棒從血管環(huán)內壁擦過，加入1×10-6 mol/L PE溶液0.1 mL至浴槽，使血管環(huán)收縮;待血管張力穩(wěn)定后，加入1×10-5 ?mol/L Ach溶液0.1 mL使血管舒張。若血管環(huán)舒張幅度小于最大收縮幅度的5%，則可認為內皮去除完全，可用于后續(xù)試驗。

2.3 OSC對正常胸主動脈環(huán)的影響考察

取“2.1”項下血管環(huán)，按累積加藥法[8]每隔2 min往浴槽中加入OSC溶液（臨用前以水配制成40 mg/mL的溶液）0.1 mL，使浴槽中OSC的累積質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL（對應給藥時間點分別記為給藥點1、2、3、4、5），作為OSC給藥組;另取“2.1”項下血管環(huán)，除以K-H營養(yǎng)液代替OSC溶液外，其余步驟同法操作，作為空白對照組。采用肌張力換能器分別于給藥點1、2、3、4、5時測定兩組血管環(huán)張力，計算其舒張率：舒張率（%）=加入OSC后血管環(huán)舒張幅度/KCl誘發(fā)血管環(huán)的最大收縮幅度×100%。試驗重復6次，記錄并比較不同時間點各組的血管環(huán)舒張率。

2.4 OSC對PE預收縮的正常胸主動脈環(huán)和去內皮胸主動脈環(huán)的影響考察

取“2.1”項下血管環(huán)和“2.2”項下去內皮血管環(huán)，分別加入1×10-6 mol/L PE溶液0.1 mL預收縮，然后按照“2.3”項下方法分為OSC給藥組和空白對照組，并同法逐次加入OSC溶液或K-H營養(yǎng)液，分別測定各組血管環(huán)張力并計算舒張率。試驗重復6次，記錄并比較不同時間點各組的血管環(huán)舒張率。

2.5 OSC對酶抑制劑預孵育的正常胸主動脈環(huán)的影響考察

取“2.1”項下血管環(huán)，分別加入1×10-4 mol/L L-NAME溶液、1×10-6 mol/L INDO溶液0.1 mL，于37 ℃預孵育20 min，分別作為L-NAME預孵育組、INDO預孵育組;另設OSC對照組，不加入L-NAME或INDO溶液預孵育。然后各組均加入1×10-6 mol/L PE溶液0.1 mL預收縮血管環(huán)后，再按“2.3”項下方法逐次加入OSC溶液，分別測定各組血管環(huán)張力并計算舒張率。試驗重復6次，記錄并比較不同時間點各組的血管環(huán)舒張率。

2.6 OSC對鉀通道阻滯劑預孵育的去內皮胸主動脈環(huán)的影響考察

取“2.2”項下去內皮血管環(huán)，分別加入1×10-3 mol/L BaCl2溶液、1×10-2 mol/L TEA溶液、5×10-3 mol/L 4-AP溶液、1×10-5 mol/L Gli溶液0.1 mL，于37 ℃孵育20 min，分別作為BaCl2預孵育組、TEA預孵育組、4-AP預孵育組、Gli預孵育組;另設OSC對照組，不加入BaCl2、TEA、4-AP或Gli溶液預孵育。然后各組均加入1×10-6 mol/L PE溶液0.1 mL預收縮血管環(huán)后，再按“2.3”項下方法逐次加入OSC溶液，分別測定各組血管環(huán)張力并計算舒張率。試驗重復6次，記錄并比較不同時間點各組的血管環(huán)舒張率。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析。試驗數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 OSC對基礎狀態(tài)的正常胸主動脈環(huán)的影響

與空白對照組比較，OSC給藥組正常血管環(huán)在不同時間點（對應的OSC累積質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，下同）時的舒張率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示上述不同質量濃度的OSC對正常胸主動脈環(huán)均無明顯舒張作用，詳見表1。

3.2 OSC對PE預收縮的正常胸主動脈環(huán)和去內皮胸主動脈環(huán)的影響

與空白對照組比較，OSC給藥組經PE預收縮的正常血管環(huán)和去內皮血管環(huán)在給藥點2、3、4、5時的舒張率均顯著升高（P<0.01）;且隨時間延長，血管舒張率呈持續(xù)升高趨勢，提示OSC對經PE預收縮的正常血管環(huán)和去內皮血管環(huán)均有舒張作用，且具有濃度依賴趨勢，詳見表2、表3。在不同質量濃度OSC作用下，正常血管環(huán)與去內皮血管環(huán)的舒張率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示OSC溶液對PE預收縮的血管環(huán)均有舒張機制，而與血管環(huán)內皮是否完整無關。

3.3 OSC對酶抑制劑孵育的正常胸主動脈環(huán)的影響

與OSC對照組比較，L-NAME預孵育組和INDO預孵育組經PE預收縮的正常血管環(huán)在給藥點1、2、3、4、5時的舒張率差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明OSC舒張血管的作用不受L-NAME、INDO的影響，詳見表4、表5。

5＼&49.60±0.17＼&3＼&0.6＼&56.27±0.13＼&57.33±0.20＼&4＼&0.8＼&63.22±0.27＼&66.38±0.21＼&5＼&1.0＼&69.39±0.74＼&73.65±0.14＼&]

3.4 OSC對鉀通道阻滯劑預孵育的去內皮胸主動脈環(huán)的影響

與OSC對照組比較，TEA預孵育組和Gli預孵育組經PE預收縮的去內皮血管環(huán)在給藥點2、3、4、5時的舒張率均顯著降低（P<0.01），表明OSC舒張血管的作用受EA和Gli的影響;BaCl2預孵育組和4-AP預孵育組經PE預收縮的去內皮血管環(huán)舒張率與OSC對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明OSC舒張血管的作用不受BaCl2和4-AP的影響，詳見表6。

4 討論

目前，我國城市和農村人口的致殘和死亡原因中居首位的疾病為腦血管病，其主要分為出血性和缺血性腦血管病兩種類型;其發(fā)病率逐年升高，病死率和致殘率極高，對人類的生命安全造成重大威脅[9-10]。已有研究證實，多種藥物在腦缺血細胞模型及動物模型上均表現出了良好的療效，但能夠進入臨床試驗并實際應用于臨床的腦缺血治療藥物卻很少，且療效并不很樂觀[11]。血管環(huán)模型在缺血性腦血管病的病理生理基礎研究和抗腦缺血的新藥篩選中占有重要地位，利用離體血管環(huán)研究因血管活性異常而引發(fā)的各種疾病的治療藥物是一種常用的重要方法[12]。因此，本研究采用離體胸主動脈血管環(huán)模型來對OSC舒張血管的作用進行探討。

血管舒張反應分為血管內皮依賴性舒張反應和非血管內皮依賴性舒張反應，前者主要與胸主動脈血管產生內皮源性舒張因子一氧化氮（NO）和前列腺素類物質有關[13]，后者主要與可影響平滑肌細胞中Ca2+內流的藥物直接作用于血管平滑肌細胞有關[14]。血管平滑肌的收縮依賴于細胞外Ca2+內流和細胞內Ca2+釋放，而Ca2+流入途徑主要通過電壓依賴性鈣通道（VDC）和受體操縱性鈣通道（ROCC）[15]。PE作用于血管α1受體后，可使其ROCC開放，通過促使細胞外Ca2+內流來收縮血管[16]。本研究結果顯示，OSC對基礎狀態(tài)的正常血管環(huán)無明顯舒張作用，但對PE預收縮的血管環(huán)有明顯的舒張作用，并呈濃度依賴趨勢，且其舒張血管環(huán)的作用并不因內皮完整或缺失而受到影響，表明OSC對血管環(huán)的舒張作用為非內皮依賴性，且可能與ROCC的開放與否有關。

NO和前列環(huán)素（PGI2）是血管內皮細胞釋放的具有強大舒血管作用的血管活性物質。其中，NO是由L-精氨酸經一氧化氮合成酶（NOS）產生，可促使細胞內Ca2+的釋放，降低細胞內Ca2+的濃度，從而起到擴張血管的作用，NOS是NO合成的關鍵限速酶[17]。PGI2由內皮細胞中的環(huán)氧合酶（COX）產生，作用于平滑肌的三磷酸肌醇（IP3）受體，激活G蛋白和腺苷酸環(huán)化酶（AC），產生環(huán)磷酸腺苷（cAMP），從而舒張平滑肌[18]。L-NAME是NOS抑制劑，可抑制血管內皮合成釋放NO[19];INDO是COX抑制劑，可抑制血管內皮釋放PGI2[20]。本研究結果顯示，經L-NAME或INDO預孵育后，OSC對經PE預收縮的正常血管環(huán)的舒張作用并未減弱，表明OSC的舒張血管作用與NO、PGI2釋放無關，進一步證實了OSC的作用機制為非內皮依賴性。

鉀通道在調節(jié)血管平滑肌舒張和收縮過程中起著重要作用，其可激活血管平滑肌上的鉀通道，引起細胞膜超極化，從而抑制細胞外Ca2+內流，起到舒張血管的作用[21]。血管平滑肌上主要有4種鉀通道，分別為內向整流鉀通道（Kir）、鈣激活鉀通道（KCa）、電壓依賴性鉀通道（KV）和ATP 敏感鉀通道（KATP）[22]，可分別被 BaCl2、TEA、4-AP、Gli所阻滯[21-23]。本研究結果顯示，經Kir阻滯劑BaCl2和KV阻滯劑4-AP干預后，OSC對經PE預收縮的去內皮血管環(huán)（去內皮是為了避免血管內皮可能產生一些對鉀通道阻滯劑作用有影響的物質）的舒張作用并未減弱，表明OSC的舒張血管作用與Kir和KV無關;而經KCa阻滯劑TEA或KATP阻滯劑Gli干預后，OSC對經PE預收縮的去內皮血管環(huán)的舒張作用明顯減弱，表明OSC的舒張血管作用可能與KCa和KATP有關。

綜上所述，OSC在本試驗劑量（0.2～1.0 mg/mL）范圍內對基礎狀態(tài)的大鼠胸主動脈環(huán)無明顯舒張作用，但0.4～1.0 mg/mL的OSC對經PE預收縮的正?；蛉绕ご笫笮刂鲃用}環(huán)均有明顯舒張作用;其舒張血管的機制為非內皮依賴性，可能與ROCC、KCa和KATP有關。

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（收稿日期：2019-05-13 修回日期：2019-09-29）

（編輯：段思怡）