唐培培郝浩浩吳俊林周權(quán)李昂姜山劉哲陳劍暉李翔*馬金婷王杭肖金勝賈峰

（1河南省煙草公司駐馬店市公司，河南駐馬店 463000；2河南省駐馬店市煙草公司泌陽縣分公司，河南泌陽 463700；3湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司襄陽卷煙廠，湖北襄陽 441000；4河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001）

煙草是一種需鉀量很大的作物，煙葉含鉀量是衡量煙葉品質(zhì)的重要指標之一[1]。但我國北方煙區(qū)的煙葉含鉀量大多不足2%[2]，直接影響煙葉品質(zhì)。提高煙葉鉀含量的方法主要有增加外施鉀肥[3]和提高鉀離子吸收[3]。煙葉AKT1基因具有對鉀離子高親和力吸收的作用[4]，AKT1蛋白主要定位于細胞膜和核膜附近的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，具有特定的保守域和Ion-trans結(jié)構(gòu)[5]，在植物鉀的吸收轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用[6]，介導(dǎo)了從低濃度鉀溶液中吸收鉀離子[7]。AKT1蛋白也可提高植株對NH4+的吸收[6]，在健壯煙苗的根部其表達量較高[8-9]。打頂后24 h內(nèi)煙草鉀離子通道基因在葉中表達量高于根，有利于鉀元素向葉中分配[10]。本研究旨在通過分析煙草中鉀離子通道基因和蛋白的生物信息學(xué)特點，為利用分子技術(shù)提高煙葉鉀含量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

分別在 NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、擬南芥數(shù)據(jù)庫（http：//www.arabidopsis.org/）、茄科數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/）以及 Nicotiana atttenuata Data Hub（http：//nadh.ice.mpg.de/NaDH/）下載9個擬南芥、9個煙草和2個番茄的AKT1基因或蛋白序列。

1.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)及疏水性分析

采用ExPaSy在線軟件Protparam（http：//web.exp asy.org/protparam/）分析蛋白序列的等電點、分子量和脂肪族氨基酸指數(shù)等性質(zhì)[11]。利用TMHMM網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)數(shù)量。利用SOPMA網(wǎng)站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和 SWISSMODEL （https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)。利用Expasy ProtScale（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）預(yù)測蛋白的疏水性。

1.3 AKT1蛋白磷酸化位點分析

利用 NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos/）分析蛋白的磷酸化位點，包括絲氨酸（Serine）、蘇氨酸（Threonine）和酪氨酸（Tyrosine）。

1.4 煙草AKT1基因的組織表達差異分析

利用Nicotiana atttenuata Data Hub中Expression中 Gene expression（http：//nadh.ice.mpg.de/NaDH/chart/expression_genes）分析基因的組織表達量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2016和PASW Statistics 18.0軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉀離子通道蛋白理化性質(zhì)分析

鉀離子通道相關(guān)蛋白的理化特性結(jié)果如表1所示。可以看出，共篩選出煙草、擬南芥和番茄鉀離子通道蛋白20個，氨基酸數(shù)目范圍為662～2 655個，其中6個煙草鉀離子通道蛋白的氨基酸數(shù)目較多，平均2 250個氨基酸，而擬南芥和番茄鉀離子通道蛋白的氨基酸數(shù)目平均為805個。20個鉀離子通道蛋白的氨基酸數(shù)量及其分子量差異較大；鉀離子通道蛋白酸性和堿性各10個，其中，9個煙草鉀離子通道蛋白中，6個為堿性，3個為酸性。鉀離子通道蛋白平均每100個氨基酸中帶負電荷殘基的總數(shù)（Asp+Glu）為10.24個，鉀離子通道口附近有帶負電荷的殘基，可提高局部陽離子濃度而降低陰離子濃度[12]；每100個氨基酸中帶正電荷殘基的總數(shù)（Arg+Lys）為10.95個，正電荷殘基對減緩鉀離子通道的宏觀失活具有重要作用[13]。9個煙草鉀離子通道蛋白中5個穩(wěn)定，4個不穩(wěn)定；9個擬南芥鉀離子通道蛋白中6個穩(wěn)定，3個不穩(wěn)定，2個番茄鉀離子通道蛋白中穩(wěn)定與不穩(wěn)定各1個。20個蛋白的脂肪族氨基酸指數(shù)平均為97.18。

表1 鉀離子通道蛋白理化性質(zhì)與二級結(jié)構(gòu)含量

煙草鉀離子通道蛋白有5個為疏水性，4個為親水性；前人研究認為煙草鉀離子通道中布滿疏水氨基酸[12]，且氨基酸的疏水特性對鉀離子通道的正常失活也很重要[13]。一般認為鉀離子通道蛋白至少有4個跨膜結(jié)構(gòu)。9個煙草鉀離子通道蛋白中3個短的通道蛋白有5個跨膜結(jié)構(gòu)，6個長的通道蛋白有9～27個跨膜結(jié)構(gòu)；而9個擬南芥鉀離子通道蛋白有7個為5個跨膜結(jié)構(gòu)，其余2個分別為 6、7個跨膜結(jié)構(gòu)；2個番茄鉀離子通道蛋白分別為3、5個跨膜結(jié)構(gòu)。

2.2 鉀離子通道蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

對鉀離子通道蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測見表1，煙草和擬南芥鉀離子通道蛋白α-螺旋的平均含量分別為37.99%和44.70%，延伸鏈的平均含量分別為22.94%和16.02%，β-轉(zhuǎn)角的平均含量分別為8.15%和6.15%，無規(guī)則卷曲平均含量分別為30.92%和33.13%。這20個蛋白的疏水性為-3.14～3.12，整體比較平衡。

由煙草NIATv7_g04651鉀離子通道蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果可看出，該蛋白由4個亞基組成，一半作為跨膜結(jié)構(gòu)通道，一半在膜外作為輔助開關(guān)結(jié)構(gòu)（圖1），與前期鉀離子通道蛋白通常由4個相同的亞基組成研究結(jié)論一致[14]。此結(jié)構(gòu)可以及時關(guān)閉通道，使胞內(nèi)的鉀離子不能釋放到細胞外。

圖1 煙草NIATv7_g04651鉀離子通道蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 鉀離子通道蛋白磷酸化位點預(yù)測分析

蛋白質(zhì)磷酸化過程是生物體內(nèi)普遍存在的信息傳導(dǎo)調(diào)節(jié)方式，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有重要作用。NIATv7_g04651、NIATv7_g07244 和 NIATv7_g14627等3個煙草鉀離子通道蛋白的磷酸化位點在蛋白兩端分布比較密集，在中間分布相對稀疏，可能在蛋白的兩端更利于磷酸化的執(zhí)行，從而調(diào)控蛋白執(zhí)行相應(yīng)功能。

2.4 鉀離子通道相關(guān)基因的組織表達差異分析

煙草鉀離子通道相關(guān)基因的組織表達差異結(jié)果如表2所示，NIATv7_g04651、NIATv7_g07244和NIATv7_g14627等3個基因均在種子中有比較高的表達；NIATv7_g04651基因主要在花器官中表達，具體在花粉管、花藥、晚期花冠以及開放的花朵中有較高的表達；NIATv7_g07244基因除了在種子中高表達之外，也在柱頭和花蕾中有較高的表達，但是該基因在其他器官中整體表達量比較低；NIATv7_g14627基因除了在種子中高表達之外，也在根、莖、葉中有較高的表達，其他器官中表達量處于中等水平。結(jié)果表明，鉀離子通道基因在器官中表達具有特異性，即在不同的器官組織中，有不同的鉀離子通道基因起作用，在不同生長發(fā)育階段有不同鉀離子通道基因發(fā)揮作用。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，9個煙草鉀離子通道蛋白中6個為堿性，3個為酸性；5個為疏水性蛋白，4個為親水性蛋白。煙草NIATv7_g04651鉀離子通道蛋白由4個亞基組成，一半作為跨膜結(jié)構(gòu)通道，一半在膜外作為輔助開關(guān)結(jié)構(gòu)。NIATv7_g04651、NIATv7_g07244和NIATv7_g14627等3個蛋白的磷酸化位點在蛋白兩端分布較密集，在中間分布相對稀疏；NIATv7_g04651、NIATv7_g07244 和 NIATv7_g14627這3個基因的組織表達具有特異性，在不同生長發(fā)育階段有不同鉀離子通道基因發(fā)揮作用。