萬宇平 馬玉華 賈芳芳 王琳琛

食品安全問題一直是社會各界關注的重點。世界衛(wèi)生組織曾報道稱，食源性疾病是受全球關注的衛(wèi)生問題，更是影響人類健康的重要因素，而病原微生物感染則是導致食源性疾病發(fā)生的主要因素。阪崎腸桿菌在2002年被國際食品微生物標準化委員會（ICMSF）確定為食源性致病菌，如被阪崎腸桿菌感染可能會引起嬰幼兒尤其是新生兒患病，如腦膜炎、菌血癥及壞死性小腸結腸炎等，更有甚者會引起嚴重的后遺癥或死亡。有數(shù)據(jù)顯示，目前只有嬰幼兒奶粉與這一疾病的爆發(fā)相關。

傳統(tǒng)的致病微生物檢測方法有國標法和紙片法，但因操作復雜且測試周期過長，其已經無法跟上經濟發(fā)展的步伐，不能滿足我國快速發(fā)展的食品行業(yè)對食品檢測工作的需求。因此，建立一種在嬰幼兒奶粉中快速、高效、靈敏的檢測阪崎腸桿菌的方法至關重要。

本研究是一種基于環(huán)介導等溫擴增技術而開發(fā)的快速檢測食品中阪崎腸桿菌的方法。環(huán)介導等溫基因擴增技術（Loop Mediated Isothermal Amplification，以下簡稱“LAMP法”）是日本榮研株式會社研究發(fā)明的核酸等溫擴增方法，其利用4個特殊的引物特異識別靶基因的6個特定區(qū)域，采用具有強鏈置換活性的BstDNA聚合酶，實現(xiàn)在恒溫條件下的體外擴增。本研究根據(jù)阪崎腸桿菌的16-23S基因設計了6條引物，并將其與目的基因的6個區(qū)域相結合，具有特異性強、靈敏度高的優(yōu)點。本試劑盒能在60min內完成擴增反應，且技術要求低，具有快速、簡便等優(yōu)點，能有效解決傳統(tǒng)檢測方法耗時長、結果可靠性差等問題，適合各級實驗室及基層單位推廣使用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

引物、DNA聚合酶、dNTP、MgSO4、Buffer緩沖液、顯色劑、DNA提取液。

PCR擴增儀。

1.2 環(huán)介導等溫基因擴增反應體系

1.2.1 制備環(huán)介導等溫基因擴增反應體系

6條引物分別如下：內引物1為5 -TAGCCAACCGATGTTTCTGTATCAAACAATACTACAAAGGTGCTTTCG-3（SEQ ID No.1）；內引物2為5-AGAAGTCATTAGCGAACAGGCTACGCGTAAGATTCTTGCTCAGTAG -3（SEQ ID No.2）；外引物1為5-GTGAGAACGGGACCATCA -3（SEQ ID No.3）；外引物2為5- CTTGTTTTTGTAGGGTTTGGA-3（SEQ ID No.4）；環(huán)引物1為5-GACTTCTTCGGGTTGTGAGG- 3（SEQ ID No.5）；環(huán)引物2為5-GATTAGCACGTCCTTCATCG- 3（SEQ ID No.6）。

DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μL；dNTP：濃度為25mM；MgSO4：濃度為50mM；Buffer緩沖液：10×buffer；顯色劑：熒光染料1000×SYBR Green I；DNA提取液。

1.2.2 鑒定阪崎腸桿菌與非阪崎腸桿菌

本實驗所述待檢樣品為添加阪崎腸桿菌的奶粉樣本。

模板DNA提?。簩?mL的樣本置于1.5mL離心管；12000r/min離心2min，棄上清；然后加入DNA提取液80μL，煮沸10min；最后離心取上清液轉移至另一支離心管中作為模板DNA。

環(huán)介導等溫基因擴增反應：在200μL PCR管配制反應體系，外引物終濃度為0.2μM，內引物、環(huán)引物終濃度為0.6μM，1×buffer反應緩沖液，3mM MgSO4，0.5mM dNTP，8U Bst DNA聚合酶，樣本模板2.5μL，超純水補足25μL，然后加入30μL的密封液，將上述反應管于65℃反應60min。

結果判定：在上述反應管中加入1μL 1000×SYBR Green I，混勻后觀察反應液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為阪崎腸桿菌，橙色則為非阪崎腸桿菌。

檢測結果：PCR管呈現(xiàn)綠色，表明待檢樣品所感染的致病菌為阪崎腸桿菌。

1.3特異性與靈敏度

1.3.1檢測材料及方法

菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 6538、單增李斯特菌CMCC（B） 54002、副溶血性弧菌 ATCC 17802、福氏志賀氏菌CMCC（B） 51572、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、阪崎腸桿菌CMCC 45410、陰溝腸桿菌CMCC45301、赫氏艾希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏菌O157 H7 ATCC 43888、大腸埃希氏菌25922、威氏李斯特CICC21672、綿羊李斯特CICC21633、格氏李斯特CICC21670。

食品樣本：幼兒配方奶粉、米粉、營養(yǎng)快線、奶片、鈣奶餅干。

檢測方法：對各個樣本的檢測嚴格按照說明書進行操作，同時與國標方法GB 4789.40-2010進行對比。

2 結果與分析

2.1 特異性

對常見食源性致病菌菌株及同源性高的菌株提取基因組DNA（按說明書制備基因組DNA），采用核酸檢測試劑盒進行單一和交叉污染檢測，每個樣品均進行2次重復檢測，并同時設立檢測試劑盒的陰性和陽性對照。（見表1）

結果顯示，僅含阪崎腸桿菌的樣品顯示陽性結果，其余樣品均為陰性，表明該試劑盒具有高度特異性。

2.2 靈敏度

純菌靈敏度（CFU/mL）：取計數(shù)后菌液進行梯度稀釋（100μL菌液+900μL超純水），按說明書提取DNA模板。取不同濃度梯度測試，每個梯度作兩個平行。

實際樣本靈敏度[CFU/25g（mL）]：取計數(shù)后菌液進行梯度稀釋（100μL菌液+900μL超純水），分別取約≥10CFU、<10CFU稀釋液進行樣本添加，置于均質袋內，按國標方式培養(yǎng)后，取200μL培養(yǎng)液上清提取模板檢測。

2.2.1純菌靈敏度（見表2）

結果顯示：純菌靈敏度數(shù)量級為102，但大量實驗結果證實，由于模板提取、稀釋誤差等原因，靈敏度數(shù)量級可能為103。因此，純菌靈敏度約為102～103CFU/mL。

2.2.2實際樣本靈敏度（見表3）

結果顯示，實際樣本的靈敏度均可達到≤10CFU/25g，個別樣本靈敏度試劑盒方法高于國標方法。

2.3 批間、批內差（“+”為陽性、“-”為陰性）

以嬰幼兒配方奶粉為樣本，進行不同量的陽性菌添加（無添加、≥10CFU、<10CFU）并制備成不同濃度的樣品，每個樣品作3個平行，3次重復，測試3批檢測試劑，同時設立陰陽對照組。（見表4）

根據(jù)實驗結果，按照公式計算，試劑盒的批內差為0%，批間差為0%，說明試劑盒穩(wěn)定性較好。

2.4 國標符合率

以嬰幼兒配方奶粉、奶片、營養(yǎng)快線、鈣奶餅干、米粉為樣本，使用不同濃度陽性菌進行樣本添加，采用核酸檢測試劑盒與國標方法同時進行檢測，比較兩種方法的檢測結果，每個檢測樣本進行3個重復檢測，同時設立試劑盒的陰性對照和陽性對照。（見表5）

結果顯示，不同樣本的檢測結果與國標一致。因此，試劑盒檢測方法與國標檢測方法的符合率為100%。

3 驗證評價

驗證實驗表明，北京勤邦生物技術有限公司研發(fā)的阪崎腸桿菌核酸檢測方法簡單、快捷，不需要大型儀器設備；純菌檢測靈敏度為102～103CFU/mL，實際樣本靈敏度均可達到≤10CFU/25g，試劑盒具有較高特異性，產品批內及批間無明顯差異，實際樣本檢測國標符合率為100%。