江瑞寧 萬苾馨 蘇新華 竇向梅

（北京市十一學(xué)校 北京 100039）

河豚魚是我國沿海地區(qū)的傳統(tǒng)美食，但是部分河豚魚有劇毒，食用后會(huì)引起中毒甚至死亡［1］。我國水產(chǎn)品管理辦法規(guī)定禁止銷售野生捕撈的河豚魚。但是我國沿海地區(qū)河豚魚資源豐富，大量捕撈的河豚魚通過各種非法途徑混入市場，例如將野生捕撈的河豚魚去除頭和皮，作為其他的魚種銷售，或?qū)⒑与圄~制成烤魚片等各種魚類制品，進(jìn)入市場銷售。這些去除形態(tài)學(xué)特征的河豚魚，使消費(fèi)者無法辨認(rèn)，致使部分消費(fèi)者誤食有毒河豚魚，從而引起中毒甚至死亡。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2005—2016年間在我國福建、上海、浙江、山東、江蘇等地即發(fā)生了8起因食用烤魚片引起的TTX 中毒事件，造成14人中毒、5人死亡，死亡率高達(dá)36%，嚴(yán)重危害消費(fèi)者的健康和生命安全。

傳統(tǒng)的河豚魚鑒定主要依賴魚類樣品外部的形態(tài)特征，不適用于魚類制品中河豚魚成分的鑒定。本研究利用PCR 技術(shù)，擴(kuò)增河豚魚特定靶基因DNA 片段，實(shí)現(xiàn)魚類制品中河豚魚成分的鑒定，防止消費(fèi)者誤食含有河豚魚成分的魚類樣品，保護(hù)消費(fèi)者身體健康。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 河豚魚樣品由福建水產(chǎn)研究院提供，并經(jīng)過專家鑒定?？爵~片樣品采自北京超市。

1.1.2 儀器與試劑 凝膠成像儀（美國Bio-Rad）、DNA 電泳儀（北京市六一儀器廠）、基因擴(kuò)增儀（美國MJ Research）、高速離心機(jī)（德國Eppendorf）、微量可調(diào)移液器（德國Brand）、渦旋振蕩器（德國IKA）、電子天平（瑞士Mettler）、微量核酸分析儀（美國NANO200）。

海洋動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒、TAE緩沖液（50×TAE Buffer）、100bp DNA ladder、dNTP Mixture(10mM each)、Gene Red 核酸染料均購自天根生化公司；PCR Nucleotide Mix 和GoTaq Flexi DNA Polymerase 購自Promega 公司。

1.1.3 引物［2］：引物由北京英駿生物技術(shù)有限公司合成。

上游引物：5′－CCT ATG GCG TGA AAA ACC AC－3′

下游引物：5′－ACA AGA CCG ACG CTC TGA AT－3′

1.2 方法

1.2.1 河豚魚基因組DNA 提取 按照海洋動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒（DP324）說明書提取DNA。100μL TE 洗脫DNA，-20℃保存。

1.2.2 PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化

1）退火溫度對(duì)PCR 反應(yīng)結(jié)果的影響。采用溫度梯度PCR 反應(yīng)，選擇PCR 反應(yīng)的最佳退火溫度。溫度范圍設(shè)定為42～68℃之間。PCR 反應(yīng)體系的配制見表1。PCR 反應(yīng)參數(shù)見表2。

表1 PCR 檢測的反應(yīng)體系

表2 PCR 檢測反應(yīng)參數(shù)

2）鎂離子濃度對(duì)PCR 反應(yīng)結(jié)果的影響。在確定了最佳退火溫度后，改變PCR 反應(yīng)體系（表1）中鎂離子的濃度，使鎂離子的終濃度分別為0mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L、3.0mmol/L、3.5mmol/L、4.0mmol/L、4.5mmol/L、5.0mmol/L、5.5mmol/L，分別做PCR 反應(yīng)，確定最佳鎂離子的濃度。

3）DNA 模板對(duì)PCR 反應(yīng)結(jié)果的影響。在確定了最佳退火溫度和最佳鎂離子濃度后，改變PCR反應(yīng)體系（表1）中DNA 模板濃度，依次加入DNA模板量分別為0μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1.0μg 和1.1μg，確定最佳的模板DNA 加入量。

1.2.3 河豚魚成分PCR 鑒定方法與其他魚種的交叉反應(yīng) 提取市場上常見水產(chǎn)品鯉魚、鯽魚和草魚的DNA，使用河豚魚PCR 鑒定方法進(jìn)行檢測，觀察河豚魚特異性引物是否與這些魚種有交叉反應(yīng)。

1.2.4 烤魚片樣品中河豚魚成分檢測 檢測從市場采集的烤魚片樣品中是否存在河豚魚成分。

2 結(jié)果

2.1 樣品中DNA 提取效果 按照試劑盒操作步驟，提取樣品DNA，用NANO200儀器測定DNA的純度和濃度（表3）。

表3 河豚魚樣品DNA 提取結(jié)果

2.2 退火溫度對(duì)PCR 反應(yīng)結(jié)果的影響 從圖1可見，隨著退火溫度的升高，PCR 反應(yīng)的雜帶逐漸減少，在退火溫度為68℃時(shí)，幾乎沒有雜帶出現(xiàn)，所以選擇68℃為最佳退火溫度。

2.3 鎂離子濃度對(duì)PCR 反應(yīng)結(jié)果的影響 從圖2可見，當(dāng)鎂離子的濃度低于2.0mmol/L 時(shí)，PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行，所以選擇鎂離子的濃度為2.0mmol/L 作為PCR 反應(yīng)的最佳鎂離子濃度。

圖2 鎂離子濃度對(duì)PCR 結(jié)果的影響

2.4 DNA 模板濃度對(duì)PCR 反應(yīng)結(jié)果的影響 從圖3可見，河豚魚DNA 的模板量達(dá)到0.1μg 時(shí)，就可以檢測到河豚魚成分。隨著河豚魚DNA 模板量逐漸增加，PCR 擴(kuò)增出的條帶也逐漸變粗和變亮。

圖3 DNA 模板對(duì)PCR 結(jié)果的影響

2.5 河豚魚成分PCR 鑒定方法與其他魚種的交叉反應(yīng) 交叉反應(yīng)是用本實(shí)驗(yàn)所建立的河豚魚PCR 檢測方法，僅能擴(kuò)增出河豚魚魚種的DNA 條帶，而不會(huì)擴(kuò)增出其他常見魚種，例如鯉魚、鯽魚等DNA 的條帶，即通過PCR 檢測，如果在800bp附近出現(xiàn)特異的DNA 條帶，則說明一定有河豚魚的DNA。在本實(shí)驗(yàn)中，提取市場上常見水產(chǎn)品鯉魚、鯽魚、青魚和草魚基因組DNA，進(jìn)行PCR 反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，僅河豚魚的DNA 在800bp 附近出現(xiàn)DNA 條帶，鯉魚、鯽魚、青魚和草魚則無DNA 條帶出現(xiàn)，說明本方法具有較好的特異性，與鯉魚、鯽魚、青魚和草魚沒有交叉反應(yīng)。

圖4 河豚魚鑒定PCR 方法特異性研究

2.6 烤魚片樣品的檢測 從市場上隨機(jī)購買烤魚片樣品3份，用PCR 方法進(jìn)行檢測，以河豚魚樣品DNA 作為陽性對(duì)照，以水作為陰性對(duì)照。電泳結(jié)果見圖5。

圖5 烤魚片樣品中河豚魚成分檢測

3 討論

3.1 PCR 最佳反應(yīng)條件的選擇 退火溫度對(duì)PCR 結(jié)果有影響。退火溫度越低，PCR 的非特異性擴(kuò)增就越多，反之，提高退火溫度，可以有效降低非特異性擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)，結(jié)果的特異性就越好。在本實(shí)驗(yàn)中，為了保證較好的檢測結(jié)果，選擇PCR 的退火溫度為68℃。

鎂離子是PCR 反應(yīng)必須的，低濃度的鎂離子不能激活Taq 酶（DNA 聚合酶），PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行，當(dāng)鎂離子達(dá)到一定濃度時(shí)，才能有效地催化Taq 酶，使PCR 反應(yīng)順利進(jìn)行。本研究中，當(dāng)鎂離子濃度大于2.0mmol/L，才能使PCR 反應(yīng)順利進(jìn)行。

模板DNA 的量對(duì)PCR 結(jié)果也有影響。適當(dāng)增加模板DNA 的量，可以使電泳結(jié)果更加清晰。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過3批次重復(fù)，河豚魚樣品的DNA 均在800bp 左右出現(xiàn)相應(yīng)電泳條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。

3.2 河豚魚特異性靶基因的選擇 應(yīng)用分子標(biāo)記和分子分類系統(tǒng)對(duì)物種進(jìn)行研究的想法要追溯到1993年［3］。2002年Tautz 等首先提出DNA 分類的概念，即以DNA 為基礎(chǔ)建立物種識(shí)別體系。2004年，Hebert 等提出利用線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）的基因序列作為物種鑒定的靶基因［4-5］。隨后Ward 等應(yīng)用COⅠ基因序列對(duì)澳大利亞270種海洋魚類進(jìn)行研究，結(jié)果顯示種內(nèi)平均差異為0.39%，屬內(nèi)的種間平均差異9.93%，科內(nèi)的種間平均差異15.5%，而目內(nèi)的種間平均差異增加到22.2%～23.3%，實(shí)驗(yàn)證明COⅠ可以成功地對(duì)魚類進(jìn)行鑒定［6］。因此，本研究選擇了河豚魚線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅰ（COⅠ）的一段長約810bp 的序列作為河豚魚鑒定的靶基因。

3.3 關(guān)于樣品檢測 本研究檢測的3份烤魚片樣品，沒有檢出河豚魚成分。這次檢測的樣品數(shù)量較少，后續(xù)應(yīng)檢測更多的樣品驗(yàn)證這種方法。由烤魚片引起的河豚毒素中毒，在我國時(shí)有發(fā)生，主要是在制作烤魚片的過程中混入了有毒的河豚魚，致使消費(fèi)者誤食河豚魚，引起中毒反應(yīng)［7］。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法無法滿足烤魚片中河豚魚成分的鑒定，因此，本研究嘗試?yán)肞CR 方法，針對(duì)河豚魚特異性靶基因進(jìn)行檢測，鑒定烤魚片中是否含有河豚魚成分，防止消費(fèi)者誤食河豚魚引起中毒反應(yīng)，這種方法是可行的。