張 麗 姜樹勤 吳彩花 周紅霞 王建華

1.邯鄲市傳染病醫(yī)院感染科 (河北 邯鄲， 056002) 2.邯鄲市傳染病醫(yī)院重癥肝病科 3.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

丙型肝炎病毒(HCV)感染是導(dǎo)致肝炎、肝硬化、肝癌發(fā)生的主要原因之一。急性HCV感染通常無明顯癥狀，60%～80%的急性HCV感染者可發(fā)展為慢性丙型肝炎(CHC)，而其中30%CHC患者可進展為肝硬化、肝癌，且肝細胞癌的發(fā)生率是正常人的20～30倍[1]。干擾素(IFN)-λs是機體細胞受到病毒感染刺激后所分泌的一類具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性的特異性細胞因子。HCV感染后可直接產(chǎn)生IFN-λs并抑制HCV的復(fù)制，IFN-λ3是IFN-λs的III型亞型。全基因組關(guān)聯(lián)研究表明，編碼IFN-λ3的IFNL3(IL28B)基因附近區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與AHC中HCV RNA的缺失相關(guān)，能夠影響HCV治療的反應(yīng)性[2]。本研究調(diào)查了AHC患者HCV感染后血清IFN-λ3水平與HCV RNA含量的變化及其相關(guān)性，并初步分析IFNL3 rs8099917基因多態(tài)性對血清IFN-λ3水平與HCV RNA含量的影響，為進一步揭示AHC疾病的發(fā)生機制提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析邯鄲市傳染病醫(yī)院收治的159例AHC患者(急性感染組)的臨床資料，患者癥狀出現(xiàn)后10天內(nèi)至邯鄲市傳染病醫(yī)院就診。其中男87例，女72例，年齡8～80歲，平均(43.11±10.34)歲。另選擇同期于邯鄲市傳染病醫(yī)院體檢的健康者100例作為對照組，醫(yī)學(xué)體檢和臨床病史調(diào)查均無肝臟疾病史，年齡8～80歲，平均(42.09±11.32)歲，其中男56例，女44例。本研究經(jīng)邯鄲市傳染病醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有受試者均知情同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)Grebely等人提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平≥400U/L，HCV RNA陽性且抗HCV抗體陰性或抗HCV抗體陽性在低臨界指數(shù)(<10)；②患者HCV感染不超過10天；③無近期自然HCV感染史和治療史；④患者同意接受相應(yīng)HCV治療；⑤所有患者乙型肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒均為陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴因感染性、毒性或自身免疫性疾病而導(dǎo)致的其他肝?。虎谟忻鞔_的急性丙肝病史，未經(jīng)任何治療痊愈者；③經(jīng)干擾素及利巴韋林抗病毒治療；④HCV感染或發(fā)病日期不明；⑤妊娠或哺乳期婦女。

1.3 臨床資料及標(biāo)本采集 收集所有受試者臨床醫(yī)學(xué)體檢和其他生化及影像學(xué)檢查資料，包括血常規(guī)、肝功能、甲狀腺功能三項、自身免疫性抗體等。采集受試者入院行體格檢查時靜脈血5ml，置于4℃待測。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.3.1 血清IFN-λ3水平檢測 入院時收集對照組與急性感染患者3ml EDTA抗凝血，4℃ 3000r/min離心5min后，采用人血清IFN-λ3 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)檢測血清IFN-λ3水平，所有操作均嚴(yán)格按照制造商說明書進行。

1.3.2 IFNL3 SNP基因分型 采用全血基因組DNA提取試劑盒(美國Sigma-Aldrich)提取基因組DNA，使用分光光度計測量提取DNA濃度，取260/280波長比為1.7～2.0之間的DNA用于后續(xù)實驗。通過焦磷酸測序儀檢測IFNL3 SNP位點(rs8099917)。

1.3.3 HCV RNA病毒定量分析 收集研究對象1.2ml EDTA抗凝血，4℃ 3000r/min離心5min后，采用全自動熒光定量PCR儀以及配套試劑進行HCV病毒定量檢測。

2 結(jié)果

2.1 急性感染組患者和對照組人員基線資料比較 見表1。

表1 基線資料在兩組人員間的差異

2.2 受試者基線血清IFN-λ3水平與HCV RNA載量比較 見表2。

表2 AHC患者與對照組基線血清IFN-λ3水平比較

與對照組相比，*P<0.05

2.3 AHC患者基線血清IFN-λ3水平與HCV RNA的關(guān)系 AHC患者基線血清IFN-λ3水平與基線HCV RNA載量呈明顯正相關(guān)(P<0.05)，見圖1。

圖1 AHC患者血清IFN-λ3水平與基線HCV RNA載量的相關(guān)性散點圖

2.4 IFNL3 SNP對AHC患者基線血清IFN-λ3水平和HCV RNA載量的影響 見表3。

表3 IFNL3 rs8099917對AHC患者基線血清IFN-λ3水平和HCV RNA載量的影響

2.5 HCV感染后影響HCV RNA載量的危險因素分析 經(jīng)Logistic多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，rs8099917基因型、IFN-λ3均是HCV RNA載量的危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 影響HCV RNA載量的多因素分析

3 討論

丙型肝炎作為一種全身性傳染病，能夠?qū)Ω闻K產(chǎn)生持續(xù)性損傷。丙型肝炎的發(fā)生機制在于HCV感染后，引起病毒血癥，同時其復(fù)制能夠干擾細胞內(nèi)大分子的合成，導(dǎo)致溶酶體膜通透性發(fā)生改變，最終引起細胞病變。急性HCV感染通常無明顯癥狀，少數(shù)患者會發(fā)生自發(fā)性清除，但60%～80%的HCV感染是持續(xù)性的，可發(fā)展為CHC，而其中30%CHC患者可進展為肝硬化和肝癌。臨床研究證實，25%以上的急性丙型肝炎患者一般在6個月內(nèi)能夠自發(fā)清除病毒[4]；此外，針對急性HCV感染的治療能夠增強病毒的清除[5]。了解自發(fā)性或治療誘導(dǎo)的HCV清除的相關(guān)因素，將改善與AHC早期干預(yù)治療有關(guān)的臨床決策。研究證實，人類白細胞抗原、炎癥趨化因子、白細胞介素、干擾素基因等均與HCV感染有關(guān)，且這些遺傳基因變異可能影響機體免疫功能，從而影響HCV感染的不同臨床結(jié)局[6]。

IFN-λ3作為III型干擾素，是由IFNL3基因編碼的抗病毒相關(guān)細胞因子，屬于IFN-λ家族成員之一。IFN-λ主要是在樹突狀細胞(DCs)對病毒蛋白產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)時產(chǎn)生，能夠通過激活JAK-STAT信號途徑，誘導(dǎo)STAT1和STAT2磷酸化，并誘導(dǎo)干擾素刺激基因3(ISGF3)復(fù)合物產(chǎn)生，進而促進2′,5′-寡腺苷酸合成酶基因家族和MxA蛋白表達，從而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[7]。肝細胞、 2型髓系樹突狀細胞(mDCs2)和漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)均能夠產(chǎn)生響應(yīng)于HCV的IFN-λ。在原代人肝細胞HCV暴露實驗中發(fā)現(xiàn)，HCV能夠誘導(dǎo)IFN-λ3產(chǎn)生[8]。另外，當(dāng)人mDCs2和pDCs暴露于HCV刺激時，不僅能夠產(chǎn)生大量IFN-λ3，而且能夠釋放少量IFN-α和IFN-β[9]。小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，HCV感染能夠誘導(dǎo)肝臟中IFN-λs基因表達。研究證實，IFN-λ3誘導(dǎo)ISGFs作為先天性免疫反應(yīng)中的第一道防線，在抗HCV病毒應(yīng)答反應(yīng)中起非常重要的作用[10]；此外，IFN-λ3能夠抑制HCV復(fù)制，并有效防止HCV擴散[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染能夠刺激機體產(chǎn)生IFN-λ3，IFN-λ3在病毒感染的肝細胞中表達，同時起到特異性抗病毒作用，其表達水平越高，對HCV的抑制作用越強。

編碼IFN-λ3的IFNL3(IL28B)基因位于19號染色體上，包含6個外顯子。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，IFNL3基因自身及上游的2個SNPs，rs8099917和rs12979860(有利的等位基因分別為TT和CC)參與影響基于IFN的HCV感染治療療效[12]。Yu等人研究發(fā)現(xiàn)，IFNL3 rs8099917等位基因T的HD受試者自發(fā)性HCV清除率較高[13]。研究表明，IFN-λ3表達水平和功能的變化可能是由IFNL3 SNP所決定[14]。Thomas發(fā)現(xiàn)，SNP rs12979860與干擾素治療應(yīng)答相關(guān)性最強，攜帶CC基因型的個體對治療產(chǎn)生應(yīng)答的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)率是攜帶TT基因型個體的2倍[15]。Suppiah等人發(fā)現(xiàn)，SNP rs8099917與HCV治療應(yīng)答相關(guān)，攜帶TT和TG基因型個體的HCV治療應(yīng)答失敗危險性顯著低于攜帶GG基因型個體[16]。其中，SNP rs8099917位于IFNL3基因本身上游啟動子區(qū)8.9db，而SNP rs12979860位于IFNL4基因的內(nèi)含子1內(nèi)[17]。故本研究主要以 rs8099917作為標(biāo)簽SNP進行分析。研究證實，SNP rs8099917能夠從轉(zhuǎn)錄水平上影響IFNL3表達，進而影響INF-3的表達和功能[18]。Tanaka[19]和Suppiah等人的研究均發(fā)現(xiàn)，攜帶INFL3 rs8099917 TT保護性基因型的人群中，血清IFN-λ3 mRNA表達顯著高于攜帶G危險等位基因的人群。這表明，IFNL3基因多態(tài)性能夠影響IFN-λ3的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，rs8099917 TT保護性基因型能夠促進IFN-λ3表達并參與AHC疾病發(fā)生過程。

研究發(fā)現(xiàn)，rs12979860 C等位基因與較高的基線HCV RNA載量有關(guān)，且這種相關(guān)性只發(fā)生在高病毒裁量的患者中，而在低HCV RNA載量組呈負相關(guān)[20]。Ikezaki等人也發(fā)現(xiàn)，rs12979860 CC基因型與較高的基線病毒載量有關(guān)[21]。而Rauch等人發(fā)現(xiàn)，IFNL3基因變異與基線HCV RNA載量無關(guān)[22]。rs8099917位點突變與AHC患者基線HCV RNA載量的關(guān)系尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶IFNL3有利等位基因能夠促進IFN-λ3的表達，增強細胞因子對ISGFs的誘導(dǎo)作用，使ISGFs表達水平上升，從而增強AHC患者HCV感染后的抗病毒應(yīng)答能力。同時本研究發(fā)現(xiàn)，rs8099917基因型、IFN-λ3均是HCV RNA含量的危險因素，血清IFN-λ3與AHC患者HCV RNA水平密切相關(guān)，并可促進疾病發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，急性丙型肝炎患者基線血清IFN-λ3水平的升高與血清HCV RNA載量呈正相關(guān)，IFNL3基因多態(tài)性能夠影響急性HCV感染患者基線IFN-λ3水平。本研究僅討論rs8099917對IFN-λ3表達水平的影響，而對IFN-λ3功能影響的研究還需更深入探究。另外，本研究樣本量較少，后續(xù)研究中應(yīng)擴大樣本量，以期為IFN-λ3與抗HCV病毒的相關(guān)機制提供更充分的實驗依據(jù)。