段路路，黃 婧，黃河清

(上海化工研究院有限公司/上?；瘜W品公共安全工程技術(shù)研究中心 上海 200062)

抗生素是指由細菌、霉菌或其他微生物在繁殖過程中產(chǎn)生的，能夠殺滅或抑制其他微生物的一類物質(zhì)及其衍生物，用于治療敏感微生物(通常為細菌或真菌)所致的感染，現(xiàn)多用作生長促進劑以加快牲畜及水產(chǎn)品的生長。雖然抗生素的半衰期不是很長，但由于其在環(huán)境中大量、頻繁地使用，可導致抗生素的污染[1]以及抗藥性的產(chǎn)生。目前，在世界多個區(qū)域的農(nóng)田中均檢測到了抗生素，其中又以四環(huán)素類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類抗生素為典型[2-5]。我國是世界上最大的抗生素原料藥生產(chǎn)國和出口大國，生產(chǎn)70多種抗生素，占全球生產(chǎn)總量的70%。近年來，由于抗生素在養(yǎng)殖業(yè)、畜牧業(yè)以及醫(yī)療衛(wèi)生上的大量使用，導致其對環(huán)境污染的問題日趨嚴重，已成為當前國內(nèi)外的研究熱點之一[6-8]。

灰黃霉素是由Oxford等[9]從灰黃青霉培養(yǎng)液中分離得到的一種含氯代謝產(chǎn)物，分子式為C17H17ClO6，為白色或類白色結(jié)晶性粉末，無臭，味微苦，可溶于丙酮、無水乙醇和二甲基甲酰胺，但在水中極微溶解[10]?；尹S霉素是一種非多烯類的物質(zhì)，作為抗真菌抗生素，在臨床上主要用于治療皮膚癬菌屬等引起的各種疾病?；尹S霉素作用機理一般，其化學結(jié)構(gòu)與鳥嘌呤相似，因此能競爭性抑制鳥嘌呤進入DNA分子，從而干擾了真菌DNA的合成以達到抑制真菌生長的目的；另外，它能與微管蛋白相結(jié)合，從而阻止真菌細胞分裂?；尹S霉素作為一種抗生素，不僅能普遍應(yīng)用于臨床治療皮膚和角質(zhì)層真菌感染，其在農(nóng)業(yè)植物保護方面也有著潛在的應(yīng)用價值。

在我國，灰黃霉素的應(yīng)用范圍已逐漸擴大到畜牧業(yè)、水產(chǎn)及植物真菌性病害的防治等，包括以內(nèi)服的方式治療牦牛毛癬、制成藥餌進行魚類水霉病的預防與防治、用質(zhì)量分數(shù)5%～10%的灰黃霉素膏劑涂抹莖部病處來防治瓜類枯萎病等[11-12]。由于土壤或沉積物是灰黃霉素的最終歸宿之地，進入環(huán)境中的灰黃霉素將在土壤或沉積物中積累，對土壤生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一定的影響，如灰黃霉素進入農(nóng)田后可能會對土壤植物、土壤動物、土壤微生物等產(chǎn)生影響，但有關(guān)這方面的影響目前還了解不多。為此，通過試驗模擬的方法研究了灰黃霉素對種子發(fā)芽和根伸長的毒性試驗、對土壤中蚯蚓急性毒性試驗、對土壤微生物(細菌、真菌、放線菌)的影響以及對土壤中脫氫酶、磷酸酶和脲酶活性的影響，旨在揭示灰黃霉素引入農(nóng)田后對土壤中生物效應(yīng)的影響，為正確評價灰黃霉素的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

(1) 供試樣品

灰黃霉素，分子式為C17H17ClO6，分子量352.77，質(zhì)量分數(shù)99.0%。

(2) 供試土壤

試驗用土壤采自內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市寧城縣八里罕鎮(zhèn)趙家溝村的棕壤土，采樣深度0～20 cm，質(zhì)地為砂壤土。新鮮土樣采集后揀去植物殘體，分成兩部分，一部分土樣直接過2.00 mm篩，混合均勻后于4 ℃下保存，供培養(yǎng)試驗使用；另一部分土樣風干后，研磨分別過2.00 mm和0.25 mm篩，用于土壤基本理化性質(zhì)的測定。經(jīng)測定，土壤基本理化性質(zhì)：pH為8.16，有機質(zhì)為12.0 g/kg，全氮為1.21 g/kg，有效磷為9.12 mg/kg，速效鉀為112.5 mg/kg，土壤容重為1.3 g/cm3，田間持水量為30%。

(3) 供試植物

10種受試植物信息如表1所示。

表1 10種受試植物信息

受試植物品系來源有效期發(fā)芽率/%青菜特矮青菜上海興綠蔬菜種苗研究所2018-08≥85甘藍京豐一號四川省綿陽市南峰蔬菜研究所2018-05≥85洋蔥金冠洋蔥王河北省邢臺興達種業(yè)有限公司2018-08≥85白菜夏抗王河北省青縣興運種苗蔬菜種子站2018-09≥85生菜意大利全年耐抽苔生菜北京科力達神禾種子有限公司2017-12≥85菜豆無筋綠地豆天津市薊農(nóng)種子有限公司2018-02≥85玉米圣尼亞北京圣尼亞種業(yè)科技有限公司2017-12≥85豇豆雙豐多收江西華農(nóng)種業(yè)有限公司2017-12≥85黃瓜新津優(yōu)1號山東泰安華益種業(yè)有限公司第一分公司2018-11≥85蘿卜特級白玉蘭上海瑞奇種業(yè)有限公司2018-09≥85

(4) 供試動物

赤子愛勝屬蚯蚓，二月齡以上，體質(zhì)量0.30～0.45 g，批次QY20170828003，由上海奉賢生態(tài)蚯蚓養(yǎng)殖場提供。試驗開始前，將蚯蚓隨機放入盛有未受污染的自然土壤培養(yǎng)箱中，土壤含水質(zhì)量分數(shù)為31%～48%，土壤pH為6.12～6.27，溫度在18.2～21.9 ℃，持續(xù)光照(400～800 Lux)下進行馴養(yǎng)，適應(yīng)期大于7 d；在試驗開始前一天，將蚯蚓放入人工土壤中馴化24 h，其間蚯蚓無異常情況，說明試材可靠。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子發(fā)芽和根伸長的毒性試驗

根據(jù)《化學品測試方法 生物系統(tǒng)效應(yīng)卷》(第2版)299 種子發(fā)芽和根伸長的毒性試驗規(guī)定的方法[13]進行灰黃霉素對種子發(fā)芽和根伸長的毒性試驗，具體操作方法為：稱取2.020 2 g灰黃霉素溶于50 mL二甲基甲酰胺中，得到質(zhì)量濃度40 000 mg/L的試驗母液；吸取試驗母液0.5、2.5、5.0和10.0 mL，分別用離子水定容至2 000 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為10、50、100和200 mg/L的試驗溶液，另外設(shè)置空白對照和二甲基甲酰胺溶劑對照(5 mL/L)；將10種受試植物種子暴露于上述溶液中，每個濃度組和對照組各設(shè)1個重復，每一重復用15粒種子，當對照組種子發(fā)芽率達到65%、根長達到20 mm時，可結(jié)束試驗?；尹S霉素對10種植物的發(fā)芽抑制率和根伸長抑制率按式(1)和式(2)進行計算：

(1)

根伸長抑制率=(平均根長空白對照-平均根長其他處理)×100/平均根長空白對照

(2)

1.2.2 蚯蚓急性毒性試驗

根據(jù)《化學品測試方法 生物系統(tǒng)效應(yīng)卷》(第2版)207 蚯蚓急性毒性試驗規(guī)定的方法[13]進行灰黃霉素對蚯蚓急性毒性試驗，灰黃霉素的含量設(shè)定為1 kg干土壤分別含1、10、30、100、300和1 000 mg灰黃霉素，同時設(shè)置空白對照。具體操作方法：準確稱量0.167 2 g灰黃霉素與99.80 g石英砂混合均勻作為母土1，稱取0.333 2、3.333 2和10.000 5 g母土1并分別與石英砂混合至10.00 g后拌入545.56 g(干質(zhì)量)人工土壤中，分別得到1 kg干土壤含1、10和30 mg灰黃霉素；另準確稱量3.000 3 g灰黃霉素與27.00 g石英砂混合均勻作為母土2，稱取0.556 1、1.667 2和5.556 3 g母土2并分別與石英砂混合至10.00 g后拌入545.56 g(干質(zhì)量)人工土壤中，分別得到1 kg干土壤含100、300和1 000 mg灰黃霉素；充分攪拌均勻后，加入一定量去離子水，測試得到土壤含水質(zhì)量分數(shù)在33.3%～34.4%，土壤pH在5.87～6.22；將處理土壤分別轉(zhuǎn)入1 L玻璃杯中并放入受試蚯蚓，然后置于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)的暴露條件為溫度(20±2) ℃、光周期24 h光照、光照強度400～800 Lux、濕度約80%。每個處理設(shè)2個平行，每個平行放置10條蚯蚓?？瞻讓φ粘瞬患邮茉囄锿?，接受同樣的處理。

人工土壤的配制：稱取2 011.3 g草炭、4 023.9 g高嶺黏土和14 037.4 g石英砂，將各組分混合并攪拌均勻，即得到20 072.6 g人工土壤。經(jīng)測定，人工土壤pH為6.14，含水質(zhì)量分數(shù)為4.7%。

1.2.3 土壤微生物的影響試驗

吸取5 mg/mL灰黃霉素溶液1.0、2.5、5.0和10.0 mL，分別與干燥的10.00 g石英砂攪拌均勻，然后邊攪拌邊加入至基質(zhì)土壤中，使土壤中灰黃霉素的含量分別達到10、25、50和100 mg/kg，同時設(shè)無灰黃霉素的對照。將配制好的土壤放置于人工氣候箱中于溫度25 ℃、濕度60%下培養(yǎng)，并分別在試驗的第0、5、10、20和30 d測定土壤中三大類微生物數(shù)量和組成，利用平板菌落計數(shù)法對土壤中細菌、放線菌和真菌分別進行計數(shù)。

基質(zhì)土壤的配制：取新鮮土壤5 g并懸浮于50 mL盛有玻璃珠的無菌水中震蕩打散；細菌培養(yǎng)選擇牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3.00 g、蛋白胨10.00 g、NaCl 0.50 g、瓊脂15.00～20.00 g、水1 000 mL、pH 7.2～7.4，121 ℃下滅菌20 min；或購置現(xiàn)成的培養(yǎng)基)，放線菌培養(yǎng)選擇高氏l號培養(yǎng)基(可溶性淀粉20.00 g、KNO3l.00 g、NaCl 0.50 g、K2HPO40.50 g、MgSO40.50 g、FeSO40.01 g、瓊脂 20.00 g、水 1 000 mL、pH 7.2～7.4，121 ℃下滅菌20 min；或購置現(xiàn)成培養(yǎng)基)，真菌培養(yǎng)選擇馬丁培養(yǎng)基(葡萄糖10.00 g、蛋白胨5.00 g、KH2PO41.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、1/3 000孟加拉紅100 mL、瓊脂15.00～20.00 g、水800 mL，112 ℃下滅菌20 min，臨用前加入質(zhì)量分數(shù)0.03%鏈霉素稀釋液100 mL；或購置現(xiàn)成的培養(yǎng)基)。

1.2.4 土壤酶活性影響試驗

吸取灰黃霉素(5 mg/mL)溶液1.0、2.5、5.0和10.0 mL，分別與干燥的10.00 g石英砂攪拌均勻，然后邊攪拌邊加入到土壤中，使土壤中抗生素含量分別達到10、25、50和100 mg/kg，同時設(shè)無抗生素的對照。將配制好的土壤放置于人工氣候箱中于溫度25 ℃、濕度60%下培養(yǎng)，并分別在試驗的第0、5、10、20和30 d測定土壤中3種酶的活性。土壤磷酸酶活性測定采用Tabatabai法[14-15]，脫氫酶活性測定采用TTC-脫氫酶比色法[16-17]，脲酶活性測定采用靛酚藍比色法[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 灰黃霉素對植物種子發(fā)芽抑制率和根伸長抑制率的影響

不同灰黃霉素質(zhì)量濃度梯度對10種植物種子發(fā)芽抑制率的試驗結(jié)果(圖1)表明：溶劑對照(即灰黃霉素質(zhì)量濃度為0 mg/L)的10種受試植物的發(fā)芽率均在90%以上；受灰黃霉素的影響，青菜、甘藍、洋蔥和白菜的發(fā)芽率略有降低，其余6種植物受灰黃霉素的影響不大，甚至在灰黃霉素存在的情況下發(fā)芽率高于溶劑對照；不同濃度的灰黃霉素對10種受試植物的種子發(fā)芽抑制率都低于50%。

圖1 不同灰黃霉素質(zhì)量濃度梯度對10種植物種子發(fā)芽抑制率的影響

不同灰黃霉素濃度梯度對10種植物根伸長抑制率的試驗結(jié)果(圖2)表明：灰黃霉素對甘藍、白菜和生菜的根伸長抑制率在10%～40%，對其余7種植物的根伸長抑制率沒有明顯的規(guī)律，甚至在某些濃度下還有促進作用；在灰黃霉素質(zhì)量濃度控制在200 mg/L以內(nèi)時，不同質(zhì)量濃度的灰黃霉素對10種植物的根伸長抑制率均小于50%，這表明在此濃度范圍內(nèi)的灰黃霉素對植物根伸長抑制作用不顯著。根據(jù)中國環(huán)保部化學品登記中心《化學品測試方法 生物系統(tǒng)效應(yīng)卷》(第2版)299種子發(fā)芽和根伸長的毒性試驗的規(guī)定，表明在200 mg/L范圍內(nèi)灰黃霉素對植物的毒性甚微。

圖2 不同灰黃霉素質(zhì)量濃度梯度對10種植物根伸長抑制率的影響

2.2 灰黃霉素對蚯蚓急性毒性的影響

不同含量灰黃霉素處理對蚯蚓毒性癥狀及累積死亡率的試驗結(jié)果(表2)表明，在1 kg干土壤含1、10、30、100、300和1 000 mg灰黃霉素的條件下，經(jīng)7 d和14 d癥狀觀察，各組供試蚯蚓未表現(xiàn)出明顯的中毒癥狀并均無死亡。由此可知，灰黃霉素對蚯蚓的急性毒性：14 d半致死含量(14d-LC50)>1 000 mg/kg，14 d死亡率為0%的最高含量(14d-LC0)≥1 000 mg/kg，14 d死亡率為100%的最低含量(14d-LC100)>1 000 mg/kg。

表2 不同含量灰黃霉素處理對蚯蚓毒性癥狀及累積死亡率的試驗結(jié)果

1 kg干土壤中灰黃霉素質(zhì)量/mg重復蚯蚓初始數(shù)量/條累積死亡率/%7 d14 d異常行為空白對照1100021000無異常11100021000無異常101100021000無異常301100021000無異常1001100021000無異常3001100021000無異常1 0001100021000無異常

2.3 土壤微生物群落組成與灰黃霉素的劑量關(guān)系

將不同含量的灰黃霉素加入土壤中培養(yǎng)，利用選擇性培養(yǎng)基在不同培養(yǎng)時間分別對細菌、真菌和放線菌計數(shù)，以培養(yǎng)時間為橫坐標、菌落總數(shù)為縱坐標作圖，研究灰黃霉素與微生物群落組成之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系隨培養(yǎng)時間的動力學變化規(guī)律，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可看出：在培養(yǎng)過程中，細菌、真菌和放線菌數(shù)量的變化范圍分別是740.0、770.0和5.1萬個/g；加入灰黃霉素之后，明顯改變了土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，尤其是細菌受到藥物抑制的影響更大，最明顯的抑制效果出現(xiàn)在培養(yǎng)的第5 d，暴露于10、25、50和100 mg/kg灰黃霉素下的土壤中細菌數(shù)量分別下降了23%、31%、59%和64%；隨著培養(yǎng)時間的延長，抑制作用隨灰黃霉素含量的增加而提高。

灰黃霉素是一種抗真菌抗生素，從圖3(b)中可以看出真菌的變化趨勢，試驗中設(shè)置的灰黃霉素含量均影響了真菌的生長。在培養(yǎng)的第5 d，10、25、50和100 mg/kg的灰黃霉素對真菌的抑制率分別為75%、78%、83%和50%；在培養(yǎng)的第10 d，所有含量水平的灰黃霉素對真菌的抑制率都達50%以上；雖然在第30 d真菌的數(shù)量有所回升，但灰黃霉素的抑制作用仍然很大。

從圖3(c)可以看出放線菌的變化趨勢，在整個培養(yǎng)期間，灰黃霉素對土壤放線菌的抑制作用從前期影響不明顯到后期影響較大，并且含量大于25 mg/kg的試驗處理對放線菌的抑制效果明顯。在培養(yǎng)的第10 d，10、25、50和100 mg/kg的灰黃霉素對放線菌的抑制率分別為17%、20%、58%和40%；在培養(yǎng)30 d后，不同含量水平的灰黃霉素對放線菌的抑制率分別達到了17%、42%、84%和86%。

2.4 灰黃霉素對土壤酶活性的影響

將不同含量的灰黃霉素加入土壤中培養(yǎng)，在每個培養(yǎng)時間段均進行了磷酸酶、脲酶和脫氫酶的活性測定，以培養(yǎng)時間為橫坐標、酶活性為縱坐標作圖，研究灰黃霉素對土壤中這3種酶活性的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖3 暴露于不同灰黃霉素含量下的土壤微生物群落變化情況

從圖4(a)可以看出：不同含量的灰黃霉素對土壤中磷酸酶活性的影響作用不大，但隨著灰黃霉素含量的增大，酶活性下降；磷酸酶活性降低最明顯的時間在培養(yǎng)的第20 d，暴露于不同含量灰黃霉素下的磷酸酶活性下降了21%～42%，在培養(yǎng)的第30 d時酶活性有所恢復。由于細菌和放線菌是土壤磷酸酶的主要提供者，在不同含量灰黃霉素的作用下，磷酸酶的活性變化與細菌、放線菌的群落變化數(shù)很相似。

由于灰黃霉素是一種非多烯類的抗真菌抗生素，而脲酶又主要是由真菌提供的，從圖4(b)中可看出，灰黃霉素對脲酶的抑制效果很明顯。加入灰黃霉素之后，土壤中脲酶的活性下降得很快，并隨著培養(yǎng)時間的推移，灰黃霉素對脲酶的抑制率逐漸增大。最明顯的抑制效果出現(xiàn)在培養(yǎng)的第10 d，暴露于10、25、50和100 mg/kg灰黃霉素下的脲酶活性分別下降了24%、39%、38%和52%，并且隨著時間的推移，抑制效率基本保持不變。

對于脫氫酶來說，灰黃霉素對脫氫酶的活性影響趨勢是先提高脫氫酶的活性，然后抑制脫氫酶的活性，而到了培養(yǎng)的第30 d，低含量的灰黃霉素仍然提高了脫氫酶的活性。

圖4 暴露于不同灰黃霉素含量下土壤酶活性變化情況

3 結(jié)語

以植物、動物、微生物和酶活性為研究對象，試驗研究了灰黃霉素對植物種子發(fā)芽和根伸長毒性的影響、對蚯蚓急性毒性的影響、對土壤微生物群落組成以及對土壤酶活性的影響，主要得出如下結(jié)論。

(1) 在200 mg/L濃度范圍內(nèi)的灰黃霉素對10種不同植物種子的發(fā)芽率和根伸長毒性沒有明顯變化，種子發(fā)芽抑制率和根伸長抑制率都在50%以內(nèi)，故在200 mg/L范圍內(nèi)灰黃霉素對植物的毒性甚微。

(2) 在1 kg干土壤含0～1 000 mg灰黃霉素范圍內(nèi)，對蚯蚓生長的影響并無顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，蚯蚓的14 d半致死含量(14d-LC50)>1 000 mg/kg，14 d死亡率為0%的最高含量(14d-LC0)≥1 000 mg/kg，14 d死亡率為100%的最低含量(14d-LC100)>1 000 mg/kg。

(3) 灰黃霉素加入到土壤中后，土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，隨著培養(yǎng)時間的推移，灰黃霉素對細菌、真菌、放線菌的抑制作用隨灰黃霉素含量的增加而提高，并且對三類微生物的影響關(guān)系是細菌>放線菌>真菌。

(4) 不同含量的灰黃霉素對土壤中磷酸酶活性的影響作用不大，但隨著灰黃霉素含量的增大，磷酸酶活性下降。灰黃霉素對脲酶的抑制作用比較大，并且隨著灰黃霉素含量的增大抑制作用加強，持續(xù)作用的時間也較長。對于脫氫酶來說，灰黃霉素對脫氫酶的活性影響趨勢是先提高其活性，然后抑制其活性。