陳 娟1，賀秋冬1，艾小紅2

(1.南華大學附屬第二醫(yī)院放療科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第一醫(yī)院放療科，湖南 衡陽 421001 )

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是頭頸部常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高達20/105～50/105，人群分布上呈現顯著種族差異性，好發(fā)于黃種人，而歐美發(fā)病率則較低。且以男性居多，男女發(fā)病率之比為2∶1～3∶1，40～60歲為發(fā)病高峰[1-3]。2018年中國新增鼻咽癌患者達60 000例左右，患者確診時多為中晚期，且遠處轉移是臨床上鼻咽癌治療效果欠佳或死亡的主要原因[4]。因此，探究鼻咽癌增殖及侵襲相關標志物對鼻咽癌的早期診斷、治療及預后具有重要的臨床意義。近期研究證實：Tiam1(T-cell lymphoma invasion and metastasis-inducing factor1)高表達與胃癌細胞的侵襲和轉移能力密切相關[5-6]，但Tiam1在鼻咽癌增殖及侵襲主要作用機制目前仍不清楚。姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗血管生成、抗腫瘤等多種功效。最近研究發(fā)現姜黃素可以通過誘導非編碼長鏈RNA表達，增強鼻咽癌細胞對放射性治療的敏感性，為鼻咽癌治療中應用姜黃素提供了依據[7]。本課題通過免疫組織化學染色方法檢測鼻咽癌組織中Tiam1的表達情況，分析鼻咽癌組織及鼻咽黏膜慢性炎癥組織中Tiam1表達情況；以鼻咽癌5-8F細胞為實驗對象，采用不同濃度的姜黃素處理鼻咽癌細胞，探討姜黃素抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖及侵襲的機制。為姜黃素治療鼻咽癌尋找新的作用靶點，為姜黃素作用于鼻咽癌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機收集從2010年1月至2013年1月期間南華大學附屬第一醫(yī)院病理科保存的鼻咽癌石蠟標本共57例，鼻咽黏膜慢性炎癥石蠟標本10例，并收集完整臨床及病理資料，所有入選鼻咽癌病例活檢前均未接受化療或放療(即初診患者)，活檢后均被病理確診為鼻咽癌病例。細胞實驗所用5-8F鼻咽癌細胞，由南華大學腫瘤研究所張志偉老師課題組饋贈。

1.2 免疫組化

南華大學附屬第一醫(yī)院病理科收集石蠟組織切片后，保存于4 ℃冰箱。實驗脫蠟前，應將鼻咽癌組織及鼻咽慢性炎性組織切片置于在65 ℃溫箱中烘烤30 min，吹風機吹3 min；然后進行脫蠟、水化、抗原修復、阻斷、封閉、一抗孵育、復染、脫水、封片。姜黃素(上海麗臣商貿有限公司)；Tiam1抗體(美國Santa Cruz公司)、鼠抗人β-actin抗體(美國Abgent公司)孵育并洗滌后采用DAB顯色，采用蘇木精復染切片，用1%鹽酸酒精分化、自來水沖洗、封片，最后送鏡檢。

1.3 結果判讀采用雙盲式閱片

組織封片待中性樹膠干燥可永久保存后，用倒置光學顯微鏡觀察，并進行拍照，每張切片先低倍鏡(100倍)下初步觀察，再于高倍鏡下(400倍)隨機選取5個視野，編號保存圖片。實驗結果判定標準[8]：Tiam1蛋白主要陽性表達于細胞漿，為淺黃至棕褐色顆粒，分布均勻，根據細胞的染色程度及陽性率進行判斷。染色程度評分標準為：不著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細胞染色率評分標準為：陰性記為0分，陽性細胞數≤10%為1分，11%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。判斷標準目前多采用積分法，公式如下：染色程度×陽性細胞率。標準參考0～2分為陰性，≥3者為陽性，每張切片至少隨機選取5個視野，每視野隨機選取100個細胞評價，取最后均值。

1.4 細胞的培養(yǎng)、復蘇、傳代及凍存

操作前準備：將已配好的新鮮培養(yǎng)基、PBS液、胰蛋白酶瓶放入37 ℃恒溫水浴鍋預熱，備用。用75%酒精擦拭超凈工作臺臺面，臺面放置移液器、TIP頭、酒精燈、打火機、污物盒紫外線照射30 min后，用75%酒精擦拭雙手，正確擺放使用器械，點燃酒精燈。5-8F細胞復蘇、細胞換液、傳代、凍存，備用。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖活力

按細胞培養(yǎng)方法將對數生長期細胞制成2×104/mL單細胞懸液，實驗設置溶劑對照組、空白對照組及5個濃度組，每組設置5個重復孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后細胞基本貼壁，加入不同濃度的姜黃素(10～160 μmol/L)各100 μL，溶媒對照組加入0.1%DMSO100 μL，空白組加入100 μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后傾去上清；用酶標儀測定波長為450 nm條件下的細胞的吸光度。

劃痕實驗:依照CCK-8實驗結果，以姜黃素處理24 h后細胞活力值繪制生長曲線所得藥物IC50為參考，選出3個實驗濃度組，分別為20、60、100 μmol/L的姜黃素實驗組；細胞培養(yǎng)方法將對數生長期細胞制成單細胞懸液，以106個細胞/孔接種于6孔板，以滅菌10 μL Tip頭在6孔板中心劃一條直線，24 h后觀察劃痕處細胞遷移情況并拍照。

侵襲實驗:取Matrigel膠與1640培養(yǎng)基，按1∶4混合均勻(冰上操作)，鋪膠(避免氣泡)，置于37 ℃、5%CO2細胞培育箱中凝膠直至出現白色固態(tài)層；不同濃度姜黃素組及空白對照組分別加入對應細胞懸液200 μL/孔；置于37 ℃、5%CO2細胞培育箱中培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察并隨機選擇3個視野進行細胞計數，拍照。

Western blot檢測:提取不同濃度藥物處理組及空白組細胞總蛋白，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳、轉膜、PVDF膜的封閉、抗體的孵育、顯色。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 Tiam1蛋白在鼻咽組織中表達

如圖1、圖2所示，通過免疫組化實驗法檢測57例不同病理類型的鼻咽癌組織及10例鼻咽黏膜慢性炎癥組織中Tiam1表達情況。實驗結果顯示Tiam1在慢性鼻咽炎組織中低表達或不表達，在鼻咽癌中陽性表達率明顯高于其在慢性鼻咽炎組織中表達率(P<0.05)。

圖1 Tiam1蛋白在不同類型鼻咽組織的表達(SP，400×)A：鼻咽黏膜慢性炎癥組織;B：鼻咽癌組織

圖2 鼻咽組織中Tiam1陽性表達率與鼻咽黏膜慢性炎癥組比較，*P<0.05

2.2 姜黃素對鼻咽癌5-8F細胞增殖活力的影響

CCK-8實驗結果顯示，實驗組細胞增殖被藥物明顯抑制，而未處理的鼻咽癌5-8F細胞體外生長情況良好，空白對照組與DMSO組增殖情況無差異(P>0.05)。圖3顯示24、48、72 h三個時間段，實驗組5-8F細胞增殖隨著姜黃素濃度改變而受到不同程度的抑制。相同姜黃素濃度處理下，因作用時間延長5-8F細胞增殖活力值下降；各組細胞處理時間一致的情況下，隨著姜黃素濃度增加，細胞增殖抑制越顯著。結果表明，姜黃素處理后細胞增殖能力降低，5-8F細胞增殖與姜黃素作用存在濃度和時間依賴性(P<0.05)。由于5-8F細胞周期約24 h，為排除細胞自然增殖對實驗的影響，選取藥物處理24 h的IC50值(56 μmol/L)作為調整實驗組濃度的依據，設置三個藥物處理組(20、60、100 μmol/L)和空白對照組繼續(xù)Transwell及Western blot實驗。

圖3 姜黃素對5-8F細胞增殖活力的影響(24h、48h、72h)與對照組比較，*P<0.05

2.3 姜黃素對鼻咽癌5-8F細胞遷移的影響

圖4、圖5所示為不同濃度姜黃素處理5-8F細胞24 h后細胞遷移變化，0 h時各組細胞劃痕距離一致，處理24 h后，空白組劃痕距離較實驗組明顯縮小，且隨著姜黃素濃度增加，其遷移的距離越短(P<0.05)。

2.4 姜黃素對鼻咽癌5-8F細胞侵襲能力的影響

圖6、圖7所示為不同濃度姜黃素處理5-8F細胞24 h后對細胞侵襲能力的影響，0 h時各組下層小室均未見穿膜細胞。處理24 h后，實驗組穿膜細胞數較空白組明顯減少，且隨著姜黃素濃度增加，其穿膜細胞數越少(P<0.05)。

圖4 0h和24h各組細胞遷移情況(10×)

圖5 姜黃素對鼻咽癌5-8F細胞遷移的影響與對照組比較，*P<0.05

2.5姜黃素對鼻咽癌5-8F細胞Tiam1蛋白表達的影響

圖8、圖9所示為不同濃度姜黃素處理5-8F細胞24 h后細胞內Tiam1蛋白變化情況?？瞻捉MTiam1蛋白表達含量明顯高于實驗組，實驗組間：100 μmol/L組Tiam1蛋白表達量低于60 μmol/L、20 μmol/L組，20 μmol/L蛋白表達量最高，差異均有統(tǒng)計學意義。姜黃素能下調5-8F細胞中Tiam1蛋白表達，從而抑制5-8F細胞。

圖6 不同濃度姜黃素對5-8F細胞侵襲能力影響(SP，200×)A:空白對照組;B:20 μmol/L組;C:60 μmol/L組;D:100 μmol/L組

圖7 不同濃度姜黃素對5-8F細胞侵襲能力影響與對照組比較，*P<0.05

圖8 姜黃素對5-8F細胞Tiam1蛋白表達的影響

圖9 姜黃素對各組細胞Tiam1蛋白表達的影響與對照組比較，*P<0.05

3 討 論

近年來，全球癌癥發(fā)病率和死亡率逐年上升，據統(tǒng)計2015年我國將新增腫瘤患者約429.2萬，因惡性腫瘤導致死亡病例約281.4萬[1]。鼻咽癌是我國“兩廣”地區(qū)常見惡性腫瘤之一，EB病毒感染，環(huán)境因素和遺傳易感性是鼻咽癌的主要病因。大部分鼻咽癌屬于放療敏感性惡性腫瘤，隨著放化療技術的不斷發(fā)展，局限期鼻咽癌患者收獲了較好的治療效果，但伴有淋巴結轉移的病例放化療后復發(fā)轉移率高，5年生存率僅為50%～60%[9]。目前鼻咽癌侵襲轉移的分子機制尚不完全明確，深入了解與鼻咽癌侵襲轉移相關的基因，對鼻咽癌的治療及預后具有深遠意義。

Tiam1是一個與腫瘤侵襲和轉移相關的基因，可特異性激活Rho蛋白家族GTPase活性，其下游效應因子主要為Rho蛋白家族重要成員Rac1，參與Rac1介導的信號通路調控發(fā)揮相應生物學效應，如細胞骨架的活動，細胞內吞作用和膜轉運，細胞遷移、粘附、侵襲、凋亡和腫瘤生成[10]。Tiam1在肝細胞癌[11]、食管癌[12]、直腸癌[13]、宮頸磷癌[14]均高表達，且與侵襲轉移密切相關。本實驗結果證實在鼻咽癌中，Tiam1蛋白高表達，實驗結果顯示Tiam1在鼻咽黏膜慢性炎癥組織中低表達或不表達，Tiam1在鼻咽癌中表達明顯高于鼻咽黏膜慢性炎癥組織。接著本實驗進一步證實中成藥姜黃素姜抑制鼻咽癌增殖及侵襲可能與Tiam1蛋白表達降低相關。

姜黃素抗腫瘤作用主要是通過與多種生物效應蛋白作用，通過這些蛋白調控轉錄因子、生長因子、受體、細胞因子和酶，抑制細胞增殖、侵襲并促進凋亡。姜黃素與放化療結合可增加治療敏感性、減輕毒副反應、甚至可逆轉腫瘤天然耐藥性[7]。本實驗運用姜黃素體外處理5-8F細胞，發(fā)現隨著姜黃素濃度增加和作用時間延長，5-8F細胞增殖活力明顯下降，增殖抑制呈濃度-時間依耐性，與Pan Y研究結果[15]相符合，說明姜黃素可以抑制鼻咽癌細胞的增殖活力。姜黃素是否能抑制鼻咽癌細胞的侵襲，本實驗進行了劃痕、Transwell實驗，進一步證實姜黃素抑制鼻咽癌細胞侵襲能力。本研究證實一定濃度姜黃素處理5-8F細胞后其侵襲能力明顯減弱。本實驗結果與Wong TS[16]研究結果相似，說明姜黃素可以抑制鼻咽癌細胞的侵襲。通過體外細胞模擬侵襲轉移過程的實驗結果，發(fā)現姜黃素對鼻咽癌細胞具有一定的抗侵襲作用，但是其具體通過何種分子機制作用仍需進一步探究可能存在的分子靶點。姜黃素處理后的5-8F細胞增殖及遷移能力均下降，其可能通過作用于多種蛋白發(fā)揮抗腫瘤效應，本實驗運用免疫印跡法檢測姜黃素處理后5-8F細胞Tiam1表達發(fā)現其表達明顯下降，說明姜黃素可能通過抑制Tiam1表達而降低鼻咽癌細胞的增殖及侵襲。

本課題初步探討鼻咽癌侵襲轉移過程中的可能靶點及機制，通過免疫組化實驗證實Tiam1在鼻咽癌組織中高表達，而姜黃素是一種具有潛在抗腫瘤轉移的中草藥，通過Western blot實驗了解不同濃度姜黃素處理的鼻咽癌細胞Tiam1蛋白表達情況，結果顯示隨著姜黃素濃度增加，鼻咽癌5-8F細胞中Tiam1的表達量下降，細胞的遷移侵襲被抑制，進一步提示姜黃素可能通過抑制侵襲相關基因Tiam1的表達而抑制鼻咽癌的侵襲。以上實驗結果初步揭示鼻咽癌的轉移可能存在的靶點及姜黃素在鼻咽癌中的藥理作用，為鼻咽癌的分期分級和治療提供一定的理論依據。