李曉凡，曹 申，馬 坤，寧 佳，郝偉亮，宋丹妮，徐 亮，張彥文*

(1.天津醫(yī)科大學藥學院，天津 300070； 2.天津市口腔醫(yī)院，天津 300041； 3.天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院，天津 300070； 4.天津市南開醫(yī)院,天津 300100； 5.天津醫(yī)學高等?？茖W校，天津 300222)

大黃是廖科植物大黃的干燥根及根莖，味苦而澀，具有瀉熱通腸，涼血解毒的功效。現(xiàn)已確定，大黃的主要成分為蒽醌類化合物，主要包括：大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素和大黃酚。目前認為，蒽醌類化合物有很好的殺菌作用，但是由于5種成分在大黃中的含量不一，其中大黃素和蘆薈大黃素含量最多，并且提取物的味道更溫和，因此選擇提取大黃素和蘆薈大黃素作為大黃中有效成分代表。

五倍子又稱文蛤、百蟲倉，是一種常用中藥，含有鞣質、沒食子酸等，主要成分為沒食子酸。沒食子酸是一種多酚類化合物，具有抑菌、抗突變、抗腫瘤的作用[1]，有低毒[2]，中國產五倍子中含有大量可水解的五倍子單寧，沒食子酸可通過水解五倍子單寧獲得[3]。

國內對大黃的抑菌作用做了一些研究，梁勤等[4]用肉湯稀釋法研究了甘肅道地藥材大黃對產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的最小抑菌濃度；侯媛媛等[5]利用UPLC-MS-MS研究了大黃對食源性致病菌大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果；宋麗琴[6]用濾紙片法研究了不同炮制條件下的大黃對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、鏈球菌等6種菌的抑制作用；李成林等[7]直接研究了大黃中有效成分大黃素和蘆薈大黃素對金黃色葡萄球菌的抑制作用。這表明，大黃中抑菌成分較多，大黃中的單一成分可以作為研究的重點。

現(xiàn)已表明五倍子的主要成分為沒食子酸，學者對五倍子抑菌作用的研究主要集中在沒食子酸的抑菌作用上。張雅麗[1]、盧曉[8]、王廣娟[9]單獨研究了沒食子酸對常見菌金黃色葡萄球菌等的抑制作用；除此之外，劉玉梅等[10]以及席清平等[11]研究了沒食子酸對幾種口腔常見菌變異鏈球菌、血鏈球菌、變形鏈球菌、粘性放線菌、牙齦卟啉單胞菌的抑制作用。表明沒食子酸抗菌效果好，應用范圍廣，可以應用于不同用途。

查閱現(xiàn)有資料，有關大黃和五倍子組合使用的文獻較少，蔣玲玲等[12-14]使用煎煮法將大黃和五倍子配伍使用，但是煎煮法存在很多問題：①產品因處于水環(huán)境下易腐敗變質；②產品質量受道地藥材的限制；③有效抑菌成分不明確，產品質量均一性差。為此，本試驗提取了大黃中的有效成分，并根據有效成分的含量和氣味、色澤等物理性質選擇了大黃素和蘆薈大黃素與五倍子的主要成分沒食子酸進行配伍，制成了一種抑菌水溶液，并且從文獻中選擇了具有代表性的幾種菌：金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、血鏈球菌、粘性放線菌、牙齦卟啉單胞菌、表兄鏈球菌[15]、內氏放線菌作為此制劑的測試菌種，經試驗，該制劑成分明確，抑菌作用較好，可應用范圍廣泛。

1 儀器與試劑

1.1儀器 SIL-20A高效液相色譜儀(日本島津)；XP205電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；比濁儀(美國BBLTM CrystalSpecTM Nephelometer公司)。

1.2試劑 甲醇(分析純，天津光復精細化工研究所)；鹽酸(分析純，天津光復精細化工研究所)；三氯甲烷(分析純，天津光復精細化工研究所)；冰醋酸(分析純，天津光復精細化工研究所)；硫酸(分析純，天津光復精細化工研究所)；石油醚(分析純，天津光復精細化工研究所)；山梨酸鉀(寧波王龍科技股份有限公司)；超純水(Milli-Q A10超純水機自制)；羧甲基纖維素鈉(上海申光食用化學品有限公司)；薄荷味食用香精(寧波威龍香精香料有限公司)；食用甘油(瑞鑫糖藝工具廠)；食用維生素C(鄭州指南針生物科技有限公司)；大黃(購于北京同仁堂天津南開大藥房，批號20180606，經天津醫(yī)科大學藥學院唐鋮教授鑒定)；蘆薈大黃素對照品(西安開來生物工程有限公司，純度為98%，批號20180825)；大黃素對照品(西安開來生物工程有限公司，純度為98%，批號20180813)； 沒食子酸對照品(西安開來生物工程有限公司，純度為98%，批號20180719)。

1.3菌種信息 內氏放線菌 (Actinomycesnaeslundii，菌落編號BNCC106505)購自北納生物，-80 ℃凍存，37 ℃、CM0006培養(yǎng)基上培養(yǎng)；血鏈球菌(Streptococcussanguinis，菌落編號BNCC134927)購自北納生物，2～8 ℃冷藏保存，37 ℃、5% CO2條件下，在哥倫比亞血平板上培養(yǎng)；牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，菌落編號BNCC 337441)購自北納生物，2～8 ℃冷藏保存，37 ℃、嚴格厭氧條件下，在即用型哥倫比亞血平板上培養(yǎng)；粘性放線菌(Actinomycesviscosus，菌落編號BNCC336944)購自北納生物，2～8 ℃冷藏保存，37 ℃、5% CO2條件下，在即用型哥倫比亞血平板上培養(yǎng)；金黃色葡萄球菌(Actinomycesviscosus，菌落編號BNCC186335)購自北納生物，2～8 ℃冷藏保存，37 ℃條件下，在營養(yǎng)瓊脂/肉汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)；變形鏈球菌(Streptococcusmutans，菌落編號ATCC700610)購自ATCC，-20 ℃保存，37 ℃、5% CO2條件下，在腦心注射瓊脂/肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)；表兄鏈球菌(Streptococcussobrinus，菌落編號ATCC700610)購自ATCC，-20 ℃保存，37 ℃、5% CO2條件下，在腦心注射瓊脂/肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

2 試驗方法

2.1大黃素及蘆薈大黃素的提取 取大黃粉50 g，置于500 ml圓底燒瓶中，加20%H2SO4溶液100 ml，氯仿50 ml，水浴回流2 h，傾出上清液，燒瓶殘渣加20%H2SO4溶液50 ml、氯仿100 ml，水浴繼續(xù)回流1 h，合并提取液，分離氯仿層，水洗兩次。將氯仿提取液置于1 000 ml分液漏斗中，以2.5%NaHCO3水液200 ml分兩次萃取，棄去水層合并氯仿層，以2.5% Na2CO3水液300 ml分兩次萃取，合并Na2CO3萃取液，加HCl酸化至pH=3，析出沉淀后靜置抽濾得大黃素，低溫干燥，以10 ml冰醋酸重結晶；合并氯仿液，以0.5% NaOH水液300 ml分兩次萃取，合并水層，用加HCl酸化至pH=3～4，析出沉淀后靜置抽濾得蘆薈大黃素，低溫干燥，以10 ml冰醋酸重結晶。

2.2高效液相色譜條件 Kromasil C18柱，(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇-水=(80∶20)，檢測波長為254 nm[16]，流速為1.0 ml/min，柱溫為25 ℃，進樣量為20 μl。

2.3抑菌試驗

2.3.13種有效成分的濃度選擇 據文獻記載，大黃素有效抑菌濃度為2～16 mg/100 ml，蘆薈大黃素的有效抑菌濃度為1～8 mg/100 ml[7]，沒食子酸的有效抑菌濃度為12.5～1 000 mg/100 ml[1,8-10]，因此本試驗對3種提取物設計了不同濃度來考查對幾種細菌的抑制作用。

2.3.2抑菌試驗步驟 將各種菌株復蘇48 h后，分別接種于腦心浸液瓊脂(BHI)液體培養(yǎng)基中，在80%氮氣、20%二氧化碳、37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h，涂片檢查為純培養(yǎng)后，應用比濁儀測定各菌懸液的濃度，用BHI培養(yǎng)基將所有菌懸液濃度調至3×108cfu/ml備用。用打孔器將中性濾紙打成直徑為6 mm的圓片，于120 ℃干熱30 min后，無菌保存?zhèn)溆?。制備含藥濾紙片時，將濾紙片置于無菌的空培養(yǎng)皿內，在超凈工作臺上，打開培養(yǎng)皿蓋，將待測藥液1 ml緩慢滴加到濾紙片上。隨后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，并置于4 ℃冰箱內浸泡過夜，然后經冷凍干燥器凍干，4 ℃密閉保存。將各菌種接種于5 ml BHI液中，95%氮氣、5%二氧化碳、37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h，應用麥氏比濁標準，調節(jié)其濃度為108cfu/ml，取50 μl接種于100 mm平皿中，涂勻，小心夾取含藥濾紙片放在瓊脂培養(yǎng)基表面，輕壓紙片，使其與瓊脂恰當接觸。在95%氮氣、5%二氧化碳、37 ℃下培養(yǎng)48 h后，用游標卡尺測各紙片的抑菌圈大小。

2.4液體抑菌制劑的制備 制劑中沒食子酸使用購買的沒食子酸標準物，大黃素和蘆薈大黃素使用實驗室提取物。量取純化水100 ml，向其中緩慢加入羧甲基纖維素鈉0.15 g，邊加邊攪拌，至羧甲基纖維素鈉完全溶解， 然后將沒食子酸800 mg溶解在上述溶液中，隨后加入大黃素8 mg、蘆薈大黃素8 mg攪拌至溶解。最后根據文獻報道[17-20]加入下列佐劑：甘油2.5 g，山梨酸鉀0.02 g，薄荷味食用香精1 ml，維生素C 3 g。

3 結果與討論

3.1大黃素和蘆薈大黃素提取試驗結果 取大黃素對照品、大黃素提取物、蘆薈大黃素對照品與蘆薈大黃素提取物分別制備成溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，結果大黃素和蘆薈大黃素提取物與大黃素和蘆薈大黃素標準品的出峰時間相同，故說明本項目的提取方法實現(xiàn)了藥材中大黃素和蘆薈大黃素的富集分離。見圖1和圖2。

3.2抑菌試驗結果 為了驗證大黃素、蘆薈大黃素和沒食子酸的抑菌效果，本文選擇了7種常見菌(金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、血鏈球菌、粘性放線菌、牙齦卟啉單胞菌、表兄鏈球菌、內氏放線菌)作為測試菌種，根據文獻設置了不同濃度梯度，試驗結果如圖3-6所示。

1.大黃素

1.蘆薈大黃素

為了探究大黃素對7種菌的抑制作用，作者查閱文獻后設計了4個濃度梯度的大黃素溶液，用濾紙片法測定了各抑菌圈的直徑，得到不同菌種抑菌圈的平均值和標準偏差后繪制了圖3的柱狀圖。由圖3可以看出，在濃度為2～8 mg/100 ml范圍內，隨著大黃素濃度的增加，大黃素對各測試菌種的抑制作用基本呈現(xiàn)上升趨勢，因此在本文所選的濃度梯度內，大黃素濃度為8 mg/100 ml時，大黃素對各測試菌種的抑制作用最大。

圖3 不同濃度的大黃素對測試菌種的抑制作用

圖4 不同濃度的蘆薈大黃素對測試菌種的抑制作用

為了探究蘆薈大黃素對7種菌的抑制作用，作者查閱文獻后設計了4個濃度梯度的蘆薈大黃素溶液，用濾紙片法測定了各抑菌圈的直徑，得到不同菌種抑菌圈的平均值和標準偏差后繪制了圖4的柱狀圖。由圖4可以看出，隨著蘆薈大黃素濃度的增加，蘆薈大黃素對7種菌的抑制作用基本都呈現(xiàn)上升的趨勢，因此在本文所選的濃度梯度內，蘆薈大黃素濃度為8 mg/100 ml對所有的測試菌種都有最大的抑制作用，各個菌種抑菌圈直徑最大。

為了探究沒食子酸對7種菌的抑制作用，經文獻調研后，作者設計了8個濃度梯度的沒食子酸溶液，用濾紙片法測定了各抑菌圈的直徑，得到不同菌種抑菌圈的平均值和標準偏差后繪制了圖5的柱狀圖。由圖5可知，在濃度為12.5～400 mg/100 ml時，隨著沒食子酸濃度的增加，沒食子酸對各測試菌種的抑制作用均增加，當沒食子酸濃度增加到800 mg/100 ml時，沒食子酸對各個菌種的抑制作用產生了差異。因此在本文所選的濃度梯度內，沒食子酸濃度為800 mg/100 ml對所有的測試菌種都有最大的抑制作用，各個菌種抑菌圈直徑最大。

綜上可知，大黃素濃度為8 mg/100 ml、蘆薈大黃素濃度為8 mg/100 ml、沒食子酸濃度為800 mg/100 ml時，對7種菌的抑制作用最強，因此以3種有效成分的最大抑菌濃度配伍制成抑菌制劑，考查其對7種菌的抑制作用，試驗結果如圖6和表1所示。由圖可知，3種化合物組合使用對測試菌種均有較強的抑菌作用，抑菌圈直徑均大于各組分單獨使用時的抑菌圈直徑(參見表1)。經SPSS軟件分析，組合后的抑菌效果與單獨使用三者相比，抑菌作用有明顯的提高。圖6和表1的結果表明3種化合物組合使用顯著增強了抑菌效果，進一步揭示3種化合物的抑菌機制可能不同，有關工作有待進一步研究。

圖5 不同濃度的沒食子酸對測試菌種的抑制作用

圖6 抑菌制劑對測試菌種的抑制作用

表1 3種提取物最大抑菌濃度抑菌圈大小及三者組合后的抑菌圈大小

4 結論及展望

本試驗從大黃中提取了大黃素和蘆薈大黃素，并將兩者分別與標準品對照后確認了提取物的成分。

查閱文獻后分別對大黃素設計了4個濃度梯度，對蘆薈大黃素設計了4個濃度梯度，對沒食子酸設計了8個濃度梯度，考查了三者對7種常見菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)當大黃素濃度為大黃素濃度為8 mg/100 ml、蘆薈大黃素濃度為8 mg/100 ml、沒食子酸濃度為800 mg/100 ml時，對各菌種的抑制作用較強；對三者按最佳抑菌效果配伍制成制劑后繼續(xù)考查其抑菌效果，發(fā)現(xiàn)抑菌作用比單獨使用各提取物的抑菌效果增強。因此該配伍方式合理，對所選菌種有很好的抑制效果。

所選菌種中除常見菌如金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌等還有部分口腔常見菌，如牙齦卟啉單胞菌、表兄鏈球菌。研究發(fā)現(xiàn)，3種提取物以及所制備的配伍制劑對口腔常見菌也有抑制作用，表明大黃和五倍子提取物可以用于口腔輔助治療，進一步可以考慮將三者配伍組合制成抑菌水劑用于臨床上的口腔輔助治療。