■賀 剛 方春林* 吳 斌 張志紅 王慶萍 王偉萍 鄧宏奎 王菊華

（1.江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西南昌330000；2.江西省科學(xué)院生物資源研究所，江西南昌330000）

中華鱉(Trionys sinensis)是重要的淡水特色養(yǎng)殖動物，具有豐富的營養(yǎng)價值和較高的經(jīng)濟(jì)價值，隨著池塘養(yǎng)殖的迅速擴(kuò)大和產(chǎn)量不斷增加，導(dǎo)致各種疾病隨之而來。在養(yǎng)殖過程中，防治水產(chǎn)動物疾病的各類抗生素和化學(xué)藥物的濫用，出現(xiàn)了養(yǎng)殖廢水污染、藥物殘留超標(biāo)、產(chǎn)品質(zhì)量下降等問題，嚴(yán)重影響了中華鱉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。中華鱉產(chǎn)品質(zhì)量安全問題，也受到廣泛的關(guān)注，微生態(tài)制劑被認(rèn)為是抗生素的有效替代物之一，通過營養(yǎng)手段提高養(yǎng)殖動物的抗病力已成為研究的熱點(diǎn)。微生態(tài)制劑具有增強(qiáng)消化酶活性、提升抗氧化功能和改善免疫應(yīng)答等功能，在一定程度上可增強(qiáng)中華鱉體質(zhì)，提升個體品質(zhì)，芽孢桿菌(Bacillus)是一種應(yīng)用較多的微生態(tài)制劑[1]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）能以芽孢的形式在各種養(yǎng)殖水體中廣泛存在，具有穩(wěn)定性、耐高溫、抗逆性等優(yōu)點(diǎn)，直接代謝產(chǎn)生多種營養(yǎng)物質(zhì)并分泌某些酶類，具有促進(jìn)生長、增強(qiáng)消化、改善內(nèi)環(huán)境、刺激免疫能力、改善養(yǎng)殖水環(huán)境等作用，是具有應(yīng)用前景廣闊的益生菌[2-3]，現(xiàn)已應(yīng)用在草魚（Ctenopharyngodon idellus）[4]、青魚(Mylopharyngodon piceus）[5]、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[6]、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)[7]、吉富羅非 魚（Genetic Improvement of Farmed Tilapia）[8]等多種水產(chǎn)動物，并取得了較好的效果。光合細(xì)菌（Photosynthetic Bacteria）是一種厭氧型革蘭氏陰性菌，分布于各種養(yǎng)殖水體的缺氧區(qū)，含多種維生素、類胡蘿卜素、輔酶Q等生理活動物質(zhì)，能凈化養(yǎng)殖水質(zhì)、吸收有害物質(zhì)，促進(jìn)腸道消化吸收，減少魚類病害發(fā)生[9-10]。目前，微生態(tài)制劑對中華鱉幼鱉相關(guān)影響的研究甚少，本研究以中華鱉幼鱉為對象，通過在基礎(chǔ)飼料中添加不同含量的微生態(tài)制劑，檢測幼鱉的生長性能、消化酶活性、血液生化免疫指標(biāo)來探討不同含量微生態(tài)制劑對中華鱉幼鱉機(jī)體的影響，為中華鱉的飼料運(yùn)用及苗種培育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物和飼料

試驗(yàn)用中華鱉幼鱉購自江西添鵬生態(tài)農(nóng)業(yè)公司，挑選初始平均體重（45.54±10.65）g 中華鱉，用5%生理鹽水浸泡4～5 min，放入溫室水泥池馴養(yǎng)7 d 后，開始進(jìn)行投喂試驗(yàn)。

按中華鱉對營養(yǎng)成分需求標(biāo)準(zhǔn)為參照，以CP%含58%進(jìn)口魚粉、43%膨化大豆、43%豆粕的原料配制基礎(chǔ)飼料，原料配比及營養(yǎng)成分見表1。

表1 飼料組成與營養(yǎng)成分（風(fēng)干，%）

試驗(yàn)用微生態(tài)制劑為復(fù)合添加劑，主要是沸石粉6.4 kg、麩皮2.8 kg、液體微生物（含枯草芽孢桿菌、光合細(xì)菌等）4 kg、殼聚糖（脫乙酰率為95%以上）100 g等物質(zhì)混合均勻制備而成，測定微生物含量為3億個/g，pH=6.8。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)幼鱉隨機(jī)分為4 組，在基礎(chǔ)飼料中添加復(fù)合制劑0（對照）、1.5 g/kg（Ⅰ組）、3 g/kg（Ⅱ組）、6 g/kg（Ⅲ組）的試驗(yàn)飼料，每組重復(fù)3 次，共12 個池，每池（5.7 m×1.9 m×1.2 m）放養(yǎng)100只，池底鋪10 cm細(xì)沙，用石棉瓦做曬背臺和食臺，水深40 cm。試驗(yàn)開始后每日投喂2次，分別在5：00～6：00和17：00～18：00投喂面團(tuán)狀飼料，日投餌量為幼鰲體質(zhì)量的3%～5%，每組設(shè)1個固定投喂點(diǎn)，投喂后2 h清理殘餌。養(yǎng)殖期間，用增氧泵不間斷增氧，水體pH值7.0～8.0，水溫27～30 ℃，每周換水一次，每次換1/3的水。養(yǎng)殖試驗(yàn)進(jìn)行60 d。

1.3 樣本采集與分析

1.3.1 生長性能

養(yǎng)殖結(jié)束后，對各池的中華鱉幼鱉進(jìn)行計(jì)數(shù)、稱重，計(jì)算增重率、特定生長率、餌料系數(shù)和存活率。

增重率(%)=[(末均重-初均重）/初均重]×100

特定生長率(%/d)=[ln(終末體質(zhì)量)-ln(初始體質(zhì)量)]/試驗(yàn)時間×100

餌料系數(shù)=攝入干物質(zhì)質(zhì)量/(末均重-初均重)

存活率(%)=每池結(jié)束存活數(shù)量/初始投入數(shù)量×100

1.3.2 消化酶活性

稱重結(jié)束后，將所有試驗(yàn)幼鱉迅速斷頸處死，各組選3～5 只取動脈血，4 ℃靜置2 h，用于血液生化指標(biāo)測定。迅速解剖，取出腸道，剔除脂肪，用4 ℃雙蒸水沖洗，濾紙吸干多余水分后放入液氮中冷凍2 min，然后置于-80 ℃冰箱中保存，供測酶活性用。

測定酶活性時，將冷凍的腸道4 ℃解凍后稱重，加入10 倍體積的4 ℃雙蒸水勻漿，然后4 ℃3 600 r/min離心15 min，上清液即為酶粗提液，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存，24 h 內(nèi)分析完畢。酶粗提液蛋胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。

1.3.3 生化指標(biāo)

將靜置的血液5 000 r/min 離心分離，收集血清，當(dāng)天測定完成，所有生化指標(biāo)均在全自動生化分析儀(MD, 美國)上完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS16.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan's法多重比較分析各試驗(yàn)組間指標(biāo)的差異，P＜0.05為差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長性能（見表2）

表2 復(fù)合微生態(tài)制劑對中華鱉幼鱉生長性能和餌料系數(shù)的影響

添加不同含量復(fù)合微生態(tài)制劑對中華鱉幼鱉體重、增重率、特定生長率、餌料系數(shù)和存活率的影響見表2。試驗(yàn)結(jié)束時，Ⅱ組體重和增重率極顯著高于對照組和Ⅰ組（P＜0.01）。Ⅱ組特定生長率極顯著高于其他試驗(yàn)組和對照組（P＜0.01），餌料系數(shù)極顯著低于對照組和其他試驗(yàn)組（P＜0.01），而Ⅲ組的增重率、特定生長率均極顯著高于對照組和Ⅰ組。餌料系數(shù)極顯著低于對照組和其他試驗(yàn)組（P＜0.01），Ⅰ組各指標(biāo)略高于對照組。此外，試驗(yàn)各組的存活率均為100%。

2.2 腸道消化酶（見表3）

表3 復(fù)合微生態(tài)制劑對中華鱉腸道消化酶活性的影響(U/g prot.)

由表3 可知，添加復(fù)合制劑的試驗(yàn)組三種酶活性均高于對照組。Ⅱ組、Ⅲ組的脂肪酶活性顯著高于對照組和Ⅰ組（P＜0.05）；Ⅱ組的淀粉酶和蛋白酶活性顯著高于其他組（P＜0.05），且Ⅰ組和Ⅲ組差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 血液生化及免疫指標(biāo)（見表4）

各試驗(yàn)組的總蛋白、白蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白均高于對照組，但組間差異不顯著（P＞0.05）。各試驗(yàn)組總膽固醇含量逐漸降低，Ⅲ組顯著低于對照組（P＜0.05），而其他組間無顯著差異。各試驗(yàn)組甘油三酯含量顯著高于對照組（P＜0.05），但Ⅱ、Ⅲ組間差異不顯著（P＞0.05）；各試驗(yàn)組的尿素氮均低于對照組（P＜0.05）。除Ⅱ、Ⅲ組的IgG低于其他試驗(yàn)組外，各試驗(yàn)組IgA、IgM、IL-2、IL-6的含量均無顯著差異（P＞0.05）。各試驗(yàn)組溶菌酶、總抗氧化能力、丙二醛、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶差異不顯著（P＞0.05），而Ⅱ組的谷胱甘肽過氧化物酶高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 復(fù)合微生態(tài)制劑對中華鱉幼鱉生長性能的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼料中添加復(fù)合微生態(tài)制劑（枯草芽孢桿菌、光合細(xì)菌和少量殼聚糖）能促進(jìn)中華鱉幼鱉生長，提高飼料利用效率，適宜添加量為3 g/kg[11-12]。當(dāng)添加量為6 g/kg時，中華鱉生長指標(biāo)和飼料利用有所下降，原因可能是過量微生態(tài)制劑造成機(jī)體腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)，還可能是由于產(chǎn)生過量的酶從而抑制有機(jī)體內(nèi)源酶的活性，降低了內(nèi)源酶對營養(yǎng)物質(zhì)的降解作用，進(jìn)一步降低了動物的生產(chǎn)性能[13]。

表4 復(fù)合微生態(tài)制劑對中華鱉血液生化及免疫指標(biāo)的影響

Wang[14]在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)飼料中同時添加光合細(xì)菌和芽孢桿菌，質(zhì)量增加率顯著提高；鞠守勇等[4]在草魚(Ctenopharyngodon idellus)飼料中添加不同含量的枯草芽孢桿菌，試驗(yàn)魚增重率和特定生長率顯著增強(qiáng)；管越強(qiáng)等[15]發(fā)現(xiàn)添加枯草芽孢桿菌飼料的中華鱉生長性能高于對照組，餌料系數(shù)有所降低。本研究表明，在飼料中添加枯草芽孢桿菌、光合細(xì)菌和少量殼聚糖的混合微生態(tài)制劑促進(jìn)幼鱉的生長，在增重率、特定生長率等指標(biāo)較為顯著。一方面芽孢桿菌競爭奪氧維持腸道厭氧環(huán)境，阻止有害菌的生長，而光合細(xì)菌能改善水體養(yǎng)殖環(huán)境，提高有機(jī)體的免疫和抗病力，兩種細(xì)菌共同協(xié)作促進(jìn)了幼鱉消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力；另一方面少量的殼聚糖能維持飼料在水中穩(wěn)定時間，減少有效成分的溶解損失，促進(jìn)有機(jī)體的生長。

3.2 復(fù)合微生態(tài)制劑對中華鱉幼鱉腸道消化酶的影響

本試驗(yàn)添加枯草芽孢桿菌、光合細(xì)菌和少量殼聚糖等復(fù)合制劑后幼鱉的腸道消化酶活性均有所改善，適宜添加量為3 g/kg。鞠守勇等[4]在飼料中添加枯草芽孢桿菌，草魚腸道中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的活性均顯著高于對照組。黃靈等[16]研究發(fā)現(xiàn)在飼料中分別添加芽孢桿菌、光合細(xì)菌制劑后，虎龍斑腸道胰蛋白酶、淀粉酶活性顯著提高。桂琳等[17]研究表明在飼料中添加1～2 g/kg 復(fù)合益生菌，平均體重為（227.48±14.42）g 中華鱉的腸道脂肪酶、淀粉酶和胰蛋白酶活性均有所增強(qiáng)。本試驗(yàn)與上述研究結(jié)果相似，研究表明，枯草芽孢桿菌、光合細(xì)菌和殼聚糖等復(fù)合制劑能提高幼鱉腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，作用機(jī)制可能是微生態(tài)復(fù)合制劑引起腸道消化酶的分泌，改善消化道的生理環(huán)境，促進(jìn)了腸道健康發(fā)育。另外，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，消化酶活性增強(qiáng)也有限制，因有機(jī)體內(nèi)要維持正常菌群平衡，當(dāng)復(fù)合制劑含量增加到一定程度時酶活性不會持續(xù)增強(qiáng)。

3.3 復(fù)合微生態(tài)制劑對中華鱉幼鱉代謝、免疫及抗氧化指標(biāo)的影響

血液中各生化指標(biāo)反映有機(jī)體內(nèi)蛋白代謝和生化免疫的水平程度?？偟鞍缀桶椎鞍资侵匾臓I養(yǎng)和健康指示器，前者主要參與多種轉(zhuǎn)運(yùn)和免疫功能，后者主要為氨基酸的合成提供能量和轉(zhuǎn)運(yùn)代謝產(chǎn)物[18]。各試驗(yàn)組與對照組的總蛋白、白蛋白含量差異均不顯著，可能是試驗(yàn)條件符合幼鱉發(fā)育生長，沒有感染疾病，飼料營養(yǎng)全面。

甘油三酯、總膽固醇是血液中脂肪的重要組成部分，其含量大小反映出脂類代謝狀況。高含量的甘油三酯、總膽固醇會引發(fā)有機(jī)體的各種疾病，適量的添加枯草芽孢桿菌、光合細(xì)菌和少量殼聚糖等復(fù)合制劑加強(qiáng)幼鱉中總膽固醇的代謝，降低了膽固醇的含量[4]。試驗(yàn)組中幼鱉血液中甘油三酯含量有所增加是由于復(fù)合制劑產(chǎn)生的各種蛋白酶促進(jìn)腸道對甘油三酯吸收。高密度脂蛋白和低密度脂蛋白是衡量脂類代謝程度的指標(biāo)[19]，低密度脂蛋白含量過高對機(jī)體有害，而高密度脂蛋白含量越高對有機(jī)有利，在這兩個指標(biāo)上，各試驗(yàn)組與對照組間總體差異不大。尿素氮指標(biāo)水平反映肝、腎臟功能的異常程度，各試驗(yàn)組的尿素氮低于對照組，可能是復(fù)合制劑促進(jìn)了蛋白質(zhì)的沉積，降低了肝、腎中尿素的積累，加快尿素從幼鱉體內(nèi)的排出，對有機(jī)體組織起到特異性保護(hù)的作用。

IgA、IgG、IgM 是血清中主要的免疫球蛋白，能維持機(jī)體生理平衡和免疫保護(hù)作用[6]；白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）均刺激T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，主要參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。本試驗(yàn)顯示，各組免疫球蛋白指標(biāo)差異不大，說明飼料營養(yǎng)價值全面，養(yǎng)殖環(huán)境單一，幼鱉病害較少。

非特異性免疫是評價幼鱉機(jī)體健康程度的重要指標(biāo)。微生態(tài)復(fù)合制劑可以刺激機(jī)體細(xì)胞和體液免疫，產(chǎn)生非特異性免疫因子，主要抗氧化、溶菌酶、補(bǔ)體系統(tǒng)等組成[20]。主要超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)氧自由基的天然去除劑；溶菌酶（LSM）可以清除體內(nèi)的異物；丙二醛是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，間接反映出細(xì)胞受損程度；谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，主要保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整和功能不受損傷[21-22]。本研究表明，各試驗(yàn)組的多數(shù)非特異免疫指標(biāo)如超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LSM）、丙二醛、過氧化物酶含量高于對照組，當(dāng)添加量為3 g/kg 時，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）含量顯著高于其他組，這可能是因?yàn)閺?fù)合制劑產(chǎn)生的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性增強(qiáng)幼鱉的抗氧化能力，與桂琳等[17]的研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

在飼料中添加復(fù)合微生態(tài)制劑（枯草芽孢桿菌、光合細(xì)菌和少量殼聚糖）能提高中華鱉幼鱉的增重率、特定生長率，降低餌料系數(shù)，增強(qiáng)腸道胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性；同時，能提高幼鱉的非特異性免疫和抗氧化能力，降低無氧代謝水平，增強(qiáng)其抗脅迫能力。復(fù)合制劑適宜添加量為3 g/kg。