■廖 珂 賀 琴 游金明* 方 華 楊 晉 羅波文 熊 昊

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省動物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江西省優(yōu)質(zhì)安全畜禽生產(chǎn)產(chǎn)教融合重點(diǎn)創(chuàng)新中心，江西南昌330045；2.上海源耀生物股份有限公司，上海201316）

仔豬因早期斷奶引起的應(yīng)激，易引發(fā)腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致腸道炎癥及腹瀉的發(fā)生，嚴(yán)重甚至導(dǎo)致死亡[1]。微生態(tài)系統(tǒng)是在一定空間結(jié)構(gòu)內(nèi)正常微生物群以其宿主的代謝產(chǎn)物、組織及細(xì)胞為環(huán)境，在長期進(jìn)化過程中形成的物質(zhì)、能量及基因能獨(dú)立相互交換的統(tǒng)一生物系統(tǒng)[2]。腸道微生態(tài)系統(tǒng)有多種功能，其不僅起著維持腸道穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)腸黏膜免疫的作用，還與炎癥性腸病、過敏性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，對動物抵抗腸道病原菌引起的感染性疾病極其重要。研究表明，正常益生菌群猶如一道屏障，能阻止病原菌的入侵與生長，因此具有提高免疫力，對抗疾病，預(yù)防胃腸道感染的作用。腸道菌群按一定的比例組合，各菌間互相制約，互相依存。當(dāng)胃腸道中有益菌群占優(yōu)勢時(shí)，能夠提高動物抗病能力；當(dāng)有害菌群占多數(shù)時(shí)，動物抵抗力下降，誘發(fā)疾病的產(chǎn)生[4-5]。動物采食的飼糧不但為動物提供所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，同樣也作為動物腸道內(nèi)微生物的發(fā)酵底物，不同的飼糧組成會直接影響動物腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)[6]。董曉麗等[7]研究表明，添加地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌復(fù)合菌制劑可以顯著降低仔豬糞便中大腸桿菌的數(shù)量，反映了其對腸道大腸桿菌的生長和繁殖具有抑制，從而維持腸道微生態(tài)平衡。劉輝等[8]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加益生菌能夠有效改善生長豬的腸道微生態(tài)環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，提高飼糧養(yǎng)分表觀消化率。豆粕是仔豬日糧中的大宗蛋白質(zhì)飼料資源，對豆粕進(jìn)行發(fā)酵或添加有益微生物不僅可以降低抗原蛋白的活性，而且可以改善仔豬腸道微生態(tài)環(huán)境。本研究旨在探討不同處理加工的豆粕和嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物對斷奶仔豬腸道微生態(tài)菌群結(jié)構(gòu)的影響，研究結(jié)果將對大豆及其制品在仔豬日糧中的科學(xué)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)酵豆粕、膨化大豆、嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物由上海源耀生物股份有限公司提供，發(fā)酵豆粕、膨化大豆以及乳桿菌培養(yǎng)物的粗蛋白質(zhì)含量分別為50%、35%和20%。

1.2 試驗(yàn)動物和分組設(shè)計(jì)

選用遺傳背景、胎次和體重相近的21 日齡斷奶仔豬240頭，按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為5個(gè)組，分別為對照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組、試驗(yàn)Ⅲ組、試驗(yàn)Ⅳ組，每個(gè)試驗(yàn)組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12頭仔豬，公母各半。

1.3 試驗(yàn)日糧和營養(yǎng)水平

在控制能量和粗蛋白質(zhì)一致的前提下，用膨化大豆和嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物來替代普通豆粕，以研究其對仔豬的影響。對照組仔豬飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧。試驗(yàn)Ⅰ組仔豬飼喂發(fā)酵豆粕代替10%普通豆粕的試驗(yàn)飼糧，試驗(yàn)Ⅱ組仔豬飼喂用膨化大豆代替對照組飼糧中豆粕的飼糧，試驗(yàn)Ⅲ組飼糧是在對照組基礎(chǔ)上用嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物代替3%原有原料，試驗(yàn)Ⅳ組飼糧是在對照組基礎(chǔ)上用嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物代替5%原有原料，飼糧配方參照NRC（2012）和我國豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（2004）配制，飼糧組成和營養(yǎng)水平見表1。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)仔豬在保育床上飼養(yǎng)，舍溫控制在25～28 ℃，濕度控制在55%～65%。自由采食和飲水，粉料飼喂。正試期21 d，仔豬免疫按常規(guī)程序執(zhí)行。試驗(yàn)第1、21 d清晨對仔豬進(jìn)行空腹個(gè)體稱重，其它日常管理按常規(guī)飼養(yǎng)管理方法進(jìn)行。

1.5 樣品采集與處理

在飼養(yǎng)至第21 d，每個(gè)重復(fù)選取1頭接近平均體重仔豬進(jìn)行屠宰，取空腸和盲腸中段兩端雙線結(jié)扎，錫箔紙包被，再用保鮮膜裹好液氮保存，用于微生物測定。

1.6 盲腸內(nèi)容物菌群組成與比例

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取盲腸內(nèi)容物菌群DNA。對DNA 樣品進(jìn)行檢測，檢測合格的樣品構(gòu)建文庫：回收目的Amplicon 片段，用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase 和T4 PNK 將打斷形成的黏性末端修復(fù)成平末端，再通過3'端加堿基“A”，使得DNA 片段能與3'端帶有“T”堿基的特殊接頭連接；最后，用合格的文庫進(jìn)行cluster 制備和測序。

表1 飼糧組成與營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.7 腸道內(nèi)容物細(xì)菌計(jì)數(shù)

稱取空腸、盲腸內(nèi)容物0.5 g 于無菌三角瓶。加入5 ml 經(jīng)滅菌的生理鹽水，振蕩3～5 min 后，用移液槍準(zhǔn)確吸取0.5 ml至盛有4.5 ml生理鹽水事先滅菌的青霉素瓶中，用旋渦振蕩器振蕩1～2 min，制成1/10稀釋液，依次進(jìn)行102～106倍稀釋。分別將空腸及盲腸內(nèi)容物稀釋液接種于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上。每種指標(biāo)檢測5 個(gè)稀釋梯度，每個(gè)梯度設(shè)3 個(gè)重復(fù)。大腸桿菌、沙門氏菌及總需氧菌于37 ℃有氧培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，產(chǎn)氣莢膜梭菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以重復(fù)為單位，以P＜0.05為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。各處理數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并分析比較不同方式處理的豆粕以及嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物對斷奶仔豬微生態(tài)系統(tǒng)的影響差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物群落門水平豐度分析（見圖1）

由圖1可知，對照組以及各試驗(yàn)組中腸道細(xì)菌共涉及12 個(gè)門，包含Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidete（擬桿菌門）、Euryarchaeot（廣古菌門）、Fibrobactere（纖維桿菌門）、Firmicute（厚壁菌門）、Unclassifie（未分類細(xì)菌）、Proteobacteri（變形細(xì)菌門）、Spirochaete（螺旋菌門）、Tenericute（軟壁菌門）、Verrucomicrobia（疣微菌門）。其中，各試驗(yàn)組中細(xì)菌種類主要為Bacteroidetes（擬桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Unclassifie（未分類細(xì)菌）和Proteobacteria（變形細(xì)菌門）。膨化大豆組仔豬腸道內(nèi)纖維桿菌門含量顯著高于對照組（P＜0.05），而對照組仔豬腸道內(nèi)纖維桿菌門的含量幾乎為零。3%嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物組以及5%嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物組有一定量的纖維桿菌門。與對照組相比，發(fā)酵豆粕組及膨化大豆組仔豬腸道內(nèi)擬桿菌門豐富度有所增加，但無顯著差異（P＞0.05）。嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物組腸道中廣古菌門數(shù)量顯著高于對照組（P＜0.05），厚壁菌門數(shù)量雖有所增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；添加膨化大豆、嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物均有降低試驗(yàn)期仔豬腸道放線菌門數(shù)量下降；添加發(fā)酵豆粕、嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物均能使仔豬腸道內(nèi)變形菌門以及螺旋菌門的數(shù)量下降。飼料中添加3%嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物能使仔豬腸道中軟壁菌門的數(shù)量減少。由此可知，飼糧中添加嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物、發(fā)酵豆粕和膨化大豆均在一定程度上提高了斷奶仔豬腸道內(nèi)擬桿菌門、廣古菌門、纖維桿菌門、厚壁菌門等有益菌的數(shù)量，降低了放線菌門、變形細(xì)菌門、螺旋菌門、軟壁菌門等有害菌的含量。

圖1 盲腸內(nèi)容物菌群物種柱狀圖（門水平）

2.2 仔豬腸道微生物群落屬水平豐度分析（見圖2）

由圖2可知，進(jìn)一步細(xì)化分類水平到屬（Genus），圖中共顯示豐度相對較高的24 個(gè)屬種，各試驗(yàn)組的Lactobacillus（乳桿菌屬）、Bacteroides（擬桿菌屬）、Megasphaera（巨球型菌屬）、Mitsuokella（光岡菌屬）、Blautia（布勞特氏菌）、Coprococcus（糞球菌屬）、Eubacterium（真桿菌屬）數(shù)量均高于對照組，對照組的Actinobacillus（放線桿菌屬）、Prevotella（普雷沃菌屬）、Campylobacter（弧形桿菌）、Clostridium-IV（梭狀芽孢桿菌四世）、Streptococcus（鏈球菌屬）數(shù)量高于各試驗(yàn)組，且Lactobacillus（乳桿菌屬）、Bacteroides（擬桿菌屬）、Megasphaera（巨球型菌屬）、Coprococcus（糞球菌屬）、Eubacterium（真桿菌屬）、Campylobacter（弧形桿菌）6種菌屬的含量存在顯著差異（P＜0.05）。3%嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物、5%嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物以及膨化大豆組的Collinsella（柯林斯菌屬）數(shù)量顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖2 盲腸內(nèi)容物菌群物種柱狀圖（屬水平）

2.3 Beta多樣性分析（見圖3）

由圖3可知，3%嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物組（試驗(yàn)Ⅲ組）和5%嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物組試驗(yàn)（試驗(yàn)Ⅳ組）與對照組物種間的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，枝長較長，三者的物種組成存在一定的差異性。發(fā)酵豆粕組（試驗(yàn)Ⅰ組）和膨化大豆組（試驗(yàn)Ⅱ組）與對照組樣品也存在一定的距離。

圖3 仔豬盲腸內(nèi)容物菌落聚類分析圖（weighted UniFrac）

2.4 盲腸內(nèi)容物細(xì)菌計(jì)數(shù)

不同方式處理的豆粕及嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物對斷奶仔豬空腸及盲腸菌群的影響見表2。從表2 可知，不同方式處理的豆粕及嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物對斷奶仔豬空腸菌群（產(chǎn)氣莢膜桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌）無顯著影響（P＞0.05）。由盲腸細(xì)菌計(jì)數(shù)顯示，3%嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物、5%嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物及膨化大豆組仔豬盲腸的乳酸菌數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05），但發(fā)酵豆粕組乳酸菌數(shù)與對照組差異不顯著（P＞0.05）。與對照組相比較，3%嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物及5%嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物使仔豬盲腸雙歧桿菌數(shù)顯著升高（P＜0.05）。各試驗(yàn)組與對照組的沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌及大腸桿菌均數(shù)不存在顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

仔豬斷奶后會出現(xiàn)胃腸道的生理紊亂，表現(xiàn)為食欲差、飼料利用率低、抗病力下降、腹瀉等現(xiàn)象[9]。引起胃腸道功能紊亂不僅是胃腸道結(jié)構(gòu)和生理的變化，而且還與腸道微生物密切相關(guān)[10]。腸道是動物機(jī)體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，同時(shí)也是機(jī)體最大的免疫器官。動物體內(nèi)存在復(fù)雜的微生物群體，這些群體對宿主營養(yǎng)消化吸收、物質(zhì)代謝及機(jī)體免疫等諸多方面起到重要作用[11]。

表2 不同方式處理的豆粕及嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物對斷奶仔豬空腸及盲腸菌群的影響lg（cfu/g）

研究發(fā)現(xiàn)，微生物群體多樣性增加通常與微生物區(qū)系的穩(wěn)定性及抗病能力呈正相關(guān)[12]。在門水平上，厚壁菌門、擬桿菌門及變形菌門是動物腸道三種主要的細(xì)菌門類[13]。斷奶仔豬腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群主要包括厚壁菌門中的乳桿菌屬、巨球型菌屬、糞球菌屬等，而腸桿菌科的比例提高可能導(dǎo)致壞死性腸炎等病癥[14]。李追[15]研究發(fā)現(xiàn)，肉仔雞飼糧中添加嗜酸乳桿菌，回腸微生物區(qū)系中厚壁菌門相對豐富度增加，變形菌門豐富度降低。本研究結(jié)果表明，通過門水平聚類分析，厚壁菌門和擬桿菌門為斷奶仔豬腸道中的優(yōu)勢菌群。與對照組相比，添加嗜酸乳桿菌組腸道厚壁菌門數(shù)量有所增加，變形菌門數(shù)量降低，而廣古菌門數(shù)量顯著升高。屬水平上，乳桿菌屬數(shù)量顯著增加，弧形桿菌屬降低。添加發(fā)酵豆粕擬桿菌門數(shù)量有所升高，糞球菌屬數(shù)量顯著上升、弧形桿菌屬顯著降低。由此可知，飼糧添加發(fā)酵豆粕、膨化大豆及嗜酸乳桿菌在一定程度上提高斷奶仔豬腸道內(nèi)有益菌群的數(shù)量，減少有害菌群的數(shù)量。而這些有益菌群不僅有利于維持盲腸微生物區(qū)系的穩(wěn)定，一定程度上能改善腸道屏障功能[16]。

腸道菌群越豐富，分配越均勻，菌種之間相互依賴和制約性就越強(qiáng)[17]。暗示在應(yīng)對應(yīng)激狀態(tài)時(shí)菌群緩沖能力越強(qiáng)，能更好地維持腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡，減少應(yīng)激帶來的危害[18]。

正常情況下，動物腸道內(nèi)各菌群相互依存，共同維持腸道動態(tài)平衡，一旦腸道微生態(tài)平衡遭到破壞，有害菌就會大量繁殖，產(chǎn)生大量有害毒素，嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體健康[19]。而仔豬斷奶階段，腸道內(nèi)乳酸桿菌數(shù)量降低，大腸桿菌數(shù)量升高，腸道正常的微生態(tài)平衡被打破，易引發(fā)腹瀉等癥狀[20]。大量研究表明，益生菌作為飼料添加劑能夠改善斷奶仔豬腸道微生態(tài)系統(tǒng)。譙仕彥等[21]發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在改善豬腸道屏障功能方面具有很好的作用，這種作用與乳酸菌對腸絨毛結(jié)構(gòu)、腸道菌群結(jié)構(gòu)、黏液的分泌、上皮細(xì)胞通透性和免疫功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。郝小燕等[22]研究表明，益生菌不僅能黏附于腸黏膜，而且能明顯抑制致病菌黏附，從而提高腸道微生態(tài)的穩(wěn)定性。研究也得到類似結(jié)果，通過盲腸細(xì)菌計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，飼糧添加嗜酸乳桿菌顯著提高盲腸乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量，而膨化大豆組盲腸內(nèi)乳酸桿菌數(shù)量顯著升高，這可能是通過競爭腸道內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)，抑制有害菌在腸道內(nèi)的附著，同時(shí)也可能通過分泌乳酸、乙酸、丙酸等降低腸腔內(nèi)pH 值，從而抑制有害菌的黏附與繁殖，有益菌發(fā)展為優(yōu)勢菌群，促進(jìn)微生態(tài)系統(tǒng)的平衡，加強(qiáng)腸道屏障功能。

4 小結(jié)

①飼糧添加發(fā)酵豆粕、膨化大豆嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物均對斷奶仔豬盲腸微生物區(qū)系產(chǎn)生了影響，添加嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物增加乳桿菌屬、擬桿菌屬相對豐富度，降低弧桿菌屬相對豐富度；添加膨化大豆及發(fā)酵豆粕增加擬桿菌屬相對豐富度，降低弧桿菌屬相對豐富度。

②飼糧添加發(fā)酵豆粕、膨化大豆及3%嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物仔豬腸道菌群豐富度增加，抵抗應(yīng)激能力相應(yīng)增強(qiáng)，腸道微生態(tài)系統(tǒng)更加穩(wěn)定,且相較之下3%嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物組效果更佳。