趙亞紅，楊 麗，劉東旭，劉 琳，遲雅麗，王 健,2，陳花山*，趙抒娜

(1中糧糖業(yè)遼寧有限公司，遼寧營(yíng)口115212；2中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室，營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京昌平102209；3中糧屯河糖業(yè)股份有限公司，農(nóng)業(yè)部糖料與番茄質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆昌吉831100)

0 前言

綿白糖簡(jiǎn)稱綿糖，是人們喜愛(ài)的調(diào)味增味甜味劑，其晶粒細(xì)小、細(xì)膩、質(zhì)地綿軟，適合直接食用，同時(shí)也可以為食品上色，在做面制品時(shí)也更易溶于面團(tuán)中[1-2]。由于綿白糖在生產(chǎn)過(guò)程中噴入了 2.5%左右的轉(zhuǎn)化糖漿，所以其還原糖分高于普通白砂糖的還原糖分。對(duì)于綿白糖中的還原糖分，如果含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致綿白糖吸潮滋生微生物，不利于綿白糖的保存，而含量過(guò)低則會(huì)影響綿白糖的風(fēng)味，因此還原糖分被列為綿白糖質(zhì)量控制國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的必檢指標(biāo)。GB/T 1445-2018《綿白糖》[3]規(guī)定綿白糖中還原糖分標(biāo)準(zhǔn)在1.5%～2.5%之間，在檢測(cè)方法上，大部分企業(yè)都是依據(jù)QB/T 5012-2016《綿白糖試驗(yàn)方法》[4]中的蘭-艾農(nóng)恒容法檢測(cè)綿白糖還原糖分。該方法用樣液滴定一定量的斐林氏試劑，滴定前加入預(yù)測(cè)的水分以保持最終容量恒定，根據(jù)耗用樣液的量，查表得校正系數(shù)，計(jì)算還原糖分的含量。該方法操作復(fù)雜，計(jì)算較繁瑣，嚴(yán)重限制其在綿白糖生產(chǎn)企業(yè)對(duì)多個(gè)批次產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)的應(yīng)用，所以需要開(kāi)發(fā)出一種操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)綿白糖中的還原糖分。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞食品中還原糖分檢測(cè)開(kāi)發(fā)了一系列的方法。張弛等[5]綜述比較了食品中還原糖測(cè)定方法，分析比較了各種方法檢驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)。張學(xué)英等[6]通過(guò)斐林試劑滴定法和 3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定菊芋中還原糖分含量，對(duì)于較高濃度樣品的檢測(cè)，平行樣檢測(cè) RSD分別為 2.00%和1.68%；但對(duì)于濃度較低(比色液糖含量低于1500 μg以下)樣品，滴定法檢測(cè)樣品平行性較差，精密度一般在 8%～13%，而比色法精密度一般在 2.0%～4.5%。田翔等[7]建立了 3,5-二硝基水楊酸比色法，通過(guò)與GB/T 5513-2008《糧油檢驗(yàn) 糧食中還原糖和非還原糖測(cè)定》[8]中鐵氰化鉀法比較分析，3,5-二硝基水楊酸比色法可代替國(guó)標(biāo)方法測(cè)定糜子還原糖。馬蓉等[9]和袁夢(mèng)等[10]采用高效液相色譜(HPLC)-示差折光測(cè)定蜂蜜中還原糖的含量；梁智安等[11]利用HPLC-示差折光測(cè)定酒中的總糖和還原糖。HPLC-示差折光法對(duì)樣品沒(méi)有特殊要求，按一定濃度配制溶液即可測(cè)定，可以快速檢測(cè)樣品中的糖類物質(zhì)，具有不破壞樣品、重現(xiàn)性好、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)[12]，在測(cè)定糖類物質(zhì)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠[13-15]。

目前，測(cè)定綿白糖還原糖的方法只有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的斐林試劑滴定法，研究HPLC-示差折光法測(cè)定綿白糖還原糖分鮮有報(bào)道。由于綿白糖與蜂蜜、酒的體系存在較大差異，需針對(duì)綿白糖特定體系開(kāi)發(fā)還原糖分含量的檢測(cè)方法。本文的目的在于以斐林試劑滴定法檢測(cè)的數(shù)據(jù)為理論值，采用HPLC-示差折光法測(cè)定綿白糖還原糖分，通過(guò)分析2種方法的相關(guān)性，并提供可靠的數(shù)據(jù)來(lái)支撐HPLC-示差折光法的準(zhǔn)確性論證，推動(dòng)HPLC-示差折光法在快速檢測(cè)綿白糖還原糖分的應(yīng)用。

1 試劑與儀器

1.1 主要試劑

綿白糖，中糧糖業(yè)遼寧有限公司；乙腈(色譜純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；磷酸氫二鈉(分析純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；磷酸二氫鈉(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；葡萄糖(標(biāo)準(zhǔn)品)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；果糖(標(biāo)準(zhǔn)品)，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 主要儀器

液相色譜儀、示差折光檢測(cè)器，大連依利特分析儀器有限公司；超純水器，Master系列；0.45 μm水相濾膜，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 干燥失重含量的測(cè)定

依據(jù)QB/T 5012-2016《綿白糖試驗(yàn)方法》[4]進(jìn)行檢測(cè)，將樣品在一定溫度及真空度的條件下進(jìn)行干燥后稱量，根據(jù)干燥前后樣品失去的質(zhì)量計(jì)算出樣品的干燥失重，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取果糖標(biāo)準(zhǔn)品0.0500 g，精確至0.0001 g，用超純水溶解并定容至5 mL，搖勻，即得濃度為10 g/L的果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.0500 g，精確至0.0001 g，用超純水溶解并定容至5 mL，搖勻，即得濃度為10 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別稱取果糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.500 g，溶解并定容至50 mL，配制成含量為10 g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。分別吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL上述混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液于10 mL的容量瓶中，用超純水定容，制備分別相當(dāng)于0.5、1、2、3、4 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，溶液過(guò) 0.45 μm水相濾膜備用。分別以 2種糖的濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析?；貧w方程見(jiàn)表1，2種糖線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.998。

色譜條件：依利特Hypersil-NH2-S色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈+磷酸鹽緩沖液=73%+27%(V︰V)，pH=5；流速：1.0 mL/min，柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20 μL；依利特RID檢測(cè)器，檢測(cè)池溫度：40℃。

表1 果糖和葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.4 綿白糖測(cè)定

稱取綿白糖樣品20.00 g，精確至0.01 g，用超純水溶解，并定容至400 mL，搖勻。稀釋3倍后，經(jīng)0.45 μm水相濾膜過(guò)濾后，根據(jù)以上設(shè)定的色譜條件進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

2.5 斐林試劑法

根據(jù)QB/T 5012-2016《綿白糖試驗(yàn)方法》[4]的方法配制溶液，采用斐林試劑法滴定還原糖，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所得數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)之間兩兩比較的成對(duì)樣本t檢驗(yàn)，配對(duì)樣本相關(guān)性P＜0.05時(shí)具有樣本相關(guān)性顯著。

3 結(jié)果與討論

3.1 譜圖分析

流動(dòng)相：乙腈+磷酸鹽緩沖液=73%+27%(V︰V)，pH=5；流速：1.0 mL/min，分別將綿白糖樣品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，其峰型分別如圖1、圖2、圖3所示，出峰時(shí)間見(jiàn)表2。

圖1 綿白糖樣品(濃度為13.33 g/L)

圖2 果糖標(biāo)準(zhǔn)品

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品

由圖1和表2可知，綿白糖樣品共有3個(gè)峰，將樣品中的第1個(gè)峰和第2個(gè)峰的出峰時(shí)間與圖2和圖3的果糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照，可以發(fā)現(xiàn)果糖、葡萄糖出峰時(shí)間相近，表明圖1第1個(gè)峰為果糖峰，第2個(gè)峰為葡萄糖峰，則第3個(gè)峰為蔗糖峰。由圖1可知綿白糖組成成分較單一，由果糖、葡萄糖和蔗糖組成，一般蔗糖分不具有還原性，還原糖分的含量實(shí)則為果糖和葡萄糖含量的總和。在計(jì)算還原糖分含量時(shí)，蔗糖分含量也可以一同計(jì)算。此外，按照流動(dòng)相條件：乙腈+磷酸鹽緩沖液=73%+27%(V︰V)，pH=5；流速：1.0 mL/min，可使檢測(cè)時(shí)成分出峰時(shí)間較短，并具有較高分離度，能夠滿足化驗(yàn)室快速檢測(cè)的要求。

3.2 檢測(cè)結(jié)果

表2 樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間

選取還原糖分含量不同的綿白糖樣品，按照QB/T 5012-2016《綿白糖試驗(yàn)方法》檢測(cè)干燥失重含量，同時(shí)采用HPLC-示差折光法和斐林試劑滴定法2種方法檢測(cè)還原糖分含量，結(jié)果如表3所示。由于綿白糖的電導(dǎo)灰分遠(yuǎn)低于蔗糖、還原糖分和水分，在計(jì)算總糖分時(shí)忽略電導(dǎo)灰分的影響，而蔗糖分和還原糖分的含量則根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的質(zhì)量濃度進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式如下所示：

總糖分(%)=100-水分含量·······················(1)

式中：C果糖為綿白糖樣品根據(jù)果糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的濃度(g/L)；C葡萄糖為綿白糖樣品根據(jù)葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的濃度(g/L)；C樣品為綿白糖樣品進(jìn)樣分析的濃度(g/L)。

3.3 方法對(duì)比分析

表3 還原糖分檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

通過(guò)圖1的譜圖分析可以看出綿白糖由3種糖組成，分別為果糖、葡萄糖和蔗糖，經(jīng)過(guò)計(jì)算分析可知，果糖、葡萄糖含量之和與斐林試劑法檢測(cè)的還原糖分含量接近，通過(guò)SPSS軟件來(lái)研究HPLC-示差折光法與斐林試劑法的相關(guān)性。根據(jù)SPSS 25.0軟件分析的結(jié)果可知：2種檢測(cè)方法下的平均值分別為2.0138 g/100g和2.0577 g/100g，標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.32351和0.34245，說(shuō)明HPLC-示差折光法的均值較低，標(biāo)準(zhǔn)差較小。經(jīng)計(jì)算2種檢測(cè)方法相關(guān)系數(shù)為0.983(P＜0.05)，由此得出2種方法的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性顯著。由表2可知，由水分含量可計(jì)算還原糖含量，HPLC-示差折光法RSD值為0.06%～0.9%，斐林試劑滴定法RSD值為0.11%～3.1%，由此得出HPLC-示差折光法要明顯低于斐林試劑法的實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，表明數(shù)據(jù)的精密度較好。

斐林試劑滴定法用樣液滴定一定量的斐林氏試劑，滴定前加入預(yù)測(cè)的水分以保持最終容量恒定，根據(jù)耗用樣液的量，查表得校正系數(shù)，計(jì)算還原糖分的含量。該方法操作復(fù)雜，計(jì)算較繁瑣，而且檢測(cè)結(jié)果易受試劑溶液顏色的影響，客觀因素對(duì)其影響因素較大，終點(diǎn)不易判定。示差折光檢測(cè)器是通過(guò)連續(xù)測(cè)定色譜柱流出液折光率的變化而對(duì)樣品濃度進(jìn)行測(cè)定的，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)所分離的組分進(jìn)行標(biāo)定，就可以準(zhǔn)確快速地得到還原糖的質(zhì)量。和斐林試劑法相比，所得結(jié)果偏差值較小，且操作簡(jiǎn)單、快速，客觀因素對(duì)其影響較小。

4 結(jié)論

本文采用HPLC-示差折光檢測(cè)法和斐林試劑滴定法檢測(cè)綿白糖中還原糖分的含量，旨在對(duì)比采用HPLC-示差折光法與斐林試劑法對(duì)綿白糖還原糖分含量進(jìn)行檢測(cè)的方法差異，初步探討研究了采用HPLC-示差折光法檢測(cè)綿白糖還原糖分含量的可行性。與斐林試劑滴定法相比，利用HPLC-示差折光法測(cè)定綿白糖中的還原糖，方法簡(jiǎn)單，操作快捷方便，能有效地測(cè)定出其還原糖含量，測(cè)定其結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本研究為HPLC-示差折光法的準(zhǔn)確性提供可靠的數(shù)據(jù)支撐，有助于推動(dòng)HPLC-示差折光法在快速檢測(cè)綿白糖還原糖分的應(yīng)用，提高制糖企業(yè)日常檢驗(yàn)分析的效率。