胡向陽(yáng)，屈新運(yùn)，吳格格，秦苗苗，劉 蕊，高天娥，李 燾

(西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西師范大學(xué)，陜西 西安 710119)

菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)是十字花科兩年生草本植物，其干燥的根和葉為歷版《中國(guó)藥典》所收錄，分別為“板藍(lán)根”和“大青葉”，其化學(xué)成分主要包括靛玉紅、靛藍(lán)、表告依春、芥子油苷、腺苷、色胺酮、棕櫚酸等[1-2]，具有抗病毒、抗菌、抗癌和抗內(nèi)毒素等作用[3-5]。

芥子油苷(Glucosinolate，GS)，又稱硫代葡萄糖苷，主要存在于白菜(Brassicapekinensis)、花椰菜(Brassicaoleracea)、菘藍(lán)(Isatisindigotica)等十字花科植物中，參與植物的防衛(wèi)反應(yīng)，具有抗癌作用，是一類重要的含氮、硫的植物次生代謝產(chǎn)物[6-8]。芥子油苷(以氨基酸為前體物)根據(jù)氨基酸種類的不同可以分為脂肪族(源于甲硫氨酸等)、吲哚族(源于色氨酸)和芳香族芥子油苷(源于苯丙氨酸等)，目前已有200余種不同結(jié)構(gòu)的芥子油苷被確認(rèn)[9-10]。CYP79酶類在芥子油苷合成通路上發(fā)揮重要作用，且具有較強(qiáng)的專一性，CYP79B1、CYP79B2和CYP79B3能夠催化色氨酸進(jìn)入吲哚族芥子油苷合成途徑[11-13]；CYP79F1和CYP79F2能夠催化甲硫氨酸(Methionine)、丙氨酸(Alanine)、纈氨酸(Valine)、亮氨酸(Leucine)和異亮氨酸(Isoleucine)并進(jìn)入脂肪族芥子油苷合成途徑[14]；CYP79A2則能夠催化丙氨酸或酪氨酸進(jìn)入芳香族芥子油苷合成途徑[15]。Banerjee等[16]用2 kGy γ射線處理白菜后發(fā)現(xiàn)MYB28和CYP79F1的表達(dá)量分別為對(duì)照組的3，2倍，脂肪族芥子油苷含量也表現(xiàn)出不同程度的升高；而影響芥子油苷積累的JA信號(hào)分子的含量卻沒(méi)有顯著變化。Chen等[12]通過(guò)敲除擬南芥CYP79F1和CYP79F2獲得相應(yīng)突變體，發(fā)現(xiàn)在CYP79F1缺失突變體中，短鏈脂肪族芥子油苷含量幾乎為零，長(zhǎng)鏈脂肪族芥子油苷含量增加；而在CYP79F2缺失突變體中，長(zhǎng)鏈脂肪族芥子油苷含量顯著降低，長(zhǎng)鏈脂肪族芥子油苷含量水平不受影響。

CYP79酶類在十字花科植物芥子油苷合成過(guò)程中具有重要作用，但其在菘藍(lán)芥子油苷的合成過(guò)程中是否發(fā)揮相應(yīng)功能目前還未有報(bào)道。本研究首次克隆了菘藍(lán)IiCYP79B2基因，綜合運(yùn)用多種生物學(xué)軟件對(duì)其序列特征進(jìn)行分析，并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行了初步的探究，這些結(jié)果也為下一步其功能研究(特別是在芥子油苷生物合成過(guò)程的功能)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

菘藍(lán)種子為西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室留存，種植于溫室中。培養(yǎng)條件：溫度(25±2)℃；光照(16 h/d)；濕度(60%～80%)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菘藍(lán)RNA和DNA的提取 取菘藍(lán)嫩葉，置于液氮中速凍。按照植物RNA提取試劑盒說(shuō)明提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA第一鏈；按照植物DNA提取試劑盒說(shuō)明提取genomic DNA(gDNA)。將菘藍(lán)cDNA和gDNA置-20 ℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的菘藍(lán)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)信息，采用ORF finder在線軟件查找菘藍(lán)CYP79B2序列的ORF，并用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性酶切引物序列:F:5′-ATGAATACTTTTACCT CAAAC-3′，R:5′-TCACTTCACCGTCGGGTAAA-3′，引物合成和序列測(cè)定由公司完成。

1.2.3 基因克隆 分別以cDNA和gDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s， 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，第2～4步33次循環(huán)； 72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存?；厥占兓瘮U(kuò)增產(chǎn)物片段，用平末端克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)方法對(duì)已經(jīng)純化的目的片段進(jìn)行連接，而后用E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，將陽(yáng)性克隆送至公司測(cè)序。

1.2.4 蛋白質(zhì)序列分析 利用ExPASy預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域等序列基本特征信息；運(yùn)用SOPMA和Swiss Model預(yù)測(cè)蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)特征信息；用Psort預(yù)測(cè)蛋白可能作用位置；NCBI搜索親緣關(guān)系較近物種的蛋白序列并比對(duì)，MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 基因表達(dá)模式分析 分別選取種子萌發(fā)后10 d(萌芽期)、30 d(幼苗期)和90 d(營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期)齡以及花期植株進(jìn)行取樣，考察目的基因在菘藍(lán)中不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況；選取花期植株的根、莖、葉、花和果進(jìn)行取樣，檢測(cè)目的基因在不同組織器官中的表達(dá)情況；為檢測(cè)不同脅迫條件對(duì)目的基因表達(dá)的影響，選取培養(yǎng)至60 d的植株分組分別噴施茉莉酸甲酯(MJ，500 μmol/L)、水楊酸(SA，300 μmol/L)和葡萄糖(Glu，9.0%m/V)溶液于整個(gè)葉面，并于0，1，3，6，12，24，48，72 h進(jìn)行取材；低溫樣本為4 ℃處理相同時(shí)間后同法取材。各條件取材樣本均于液氮速凍后置-80 ℃，備用。

按照1.2.1項(xiàng)的方法分別獲得上述材料的cDNA，并設(shè)計(jì)目的基因的qRT-PCR引物：F:5′-TGGGCCG TAACCCGAAAGTTTGG-3′，R:5′-ATCGTGGTCAAC GCCGTACCTAGGG-3′。以IiActin(AY870652.1)為內(nèi)參基因，其引序列物為：F3:5′-AGGAATCGCTGA CCGTATG-3′，R3:5′-TGGACCCGACTCATCGTATT-3′。qRT-PCR法分析目的基因的表達(dá)模式。擴(kuò)增條件為： 95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃ 延伸10 s，45次循環(huán)；72 ℃終延伸10 min,4 ℃保存，每次循環(huán)第3步進(jìn)行熒光信號(hào)采集，采用2-ΔΔCT法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 IiCYP79B2基因的克隆

以菘藍(lán)的cDNA和gDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)在1 500～2 000 bp分別獲得1個(gè)片段(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示：基因組序列全長(zhǎng)1 827 bp，只有1個(gè)內(nèi)含子(剪切位點(diǎn)為GT-AG，圖2)。去除后ORF全長(zhǎng)1 629 bp，編碼542個(gè)氨基酸，將其命名為IiCYP79B2，GenBank登錄號(hào)為KY774688(圖3)。

2.2 IiCYP79B2蛋白的分析

2.2.1 IiCYP79B2蛋白的理化性質(zhì)分析 結(jié)果表明，IiCYP79B2蛋白的理論分子質(zhì)量61.41 ku，分子結(jié)構(gòu)式為C2748H4371N739O781S36，理論等電點(diǎn)(pI)8.80，偏堿性；不穩(wěn)定系數(shù)33.29，相對(duì)穩(wěn)定；總平均親水性(GRAVY)-0.188，親水性蛋白；存在2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，在氨基酸序列第20-42位和55-74位；預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位于葉綠體類囊體膜上(可信度：0.821)，無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)；N-端氨基酸為蛋氨酸(Met)；IiCYP79B2含有46個(gè)蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，包括22個(gè)Ser位點(diǎn)、22個(gè)Thr位點(diǎn)和2個(gè)Tyr位點(diǎn)，可能受蛋白磷酸激酶的調(diào)控。

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1.cDNA；2.gDNA。M.DL2000 Marker; 1.cDNA; 2.gDNA.

圖2 IiCYP79B2的內(nèi)含子Fig.2 The intron of IiCYP79B2

圖3 IiCYP79B2核酸及推導(dǎo)氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of IiCYP79B2

2.2.2 IiCYP79B2蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 結(jié)果表明，IiCYP79B2蛋白在471-480位氨基酸之間有一高度保守的血紅素結(jié)合域：FStGKRGCAA(圖4)，具有CYP450基因家族酶系的典型特征。IiCYP79B2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋(Alphha helix)、無(wú)規(guī)則卷曲螺旋(Coiled coils)、延伸鏈(Extended strand)和β-轉(zhuǎn)角(β-turn)分別占比44.28%，31.18%，17.34%和7.20%，以前兩者為主。IiCYP79B2蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果吻合(圖5)。

圖4 IiCYP79B2的蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.4 Functional domain of IiCYP79B2

圖5 IiCYP79B2的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Three-dimensional structure model of IiCYP79B2

IiCYP79B2蛋白的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析 各植物CYP79B2同源序列比對(duì)結(jié)果表明：菘藍(lán)IiCYP79B2與其他物種的CYP79B2序列相似，高度同源，都具有Heme-binding motif、PERF motif和K-helix 3種CYP450家族典型結(jié)構(gòu)域或基序，如圖6所示。菘藍(lán)IiCYP79B2的氨基酸序列與芝麻菜(Erucasativa, AGM16417.1)、深山南芥(Arabidopsislyrata, EFH43155.1)和擬南芥(Arabidopsisthaliana, OAO99245.1)CYP79B2序列的相似性分別為96%，95%和95%；系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，菘藍(lán)IiCYP79B2與白芥(Sinapisalba, O81345.1)的親緣關(guān)系最近(圖7)。

黑色方框.CYP450保守的基序、區(qū)域和結(jié)構(gòu)域；黃色.相同的氨基酸；粉色和藍(lán)色.同源的氨基酸殘基。Black box.CYP450s conserved motifs, regions and domains; The identical amino acid was highlighted in yellow box; The indicate homologous amino acid residues were highlighted in pink and blue box.

圖7 IiCYP79B2系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree of IiCYP79B2

2.3 IiCYP79B2基因的表達(dá)模式分析

2.3.1IiCYP79B2在不同發(fā)育時(shí)期和組織部位的表達(dá)特性IiCYP79B2基因在菘藍(lán)不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)(圖8-A)，各發(fā)育時(shí)期表達(dá)量依次為生長(zhǎng)期>花期>幼苗期>萌芽期，其中生長(zhǎng)期表達(dá)量最高，為萌芽期的14.78倍；此外，該基因在菘藍(lán)的根、莖、葉、花和果中均有表達(dá)(圖8-B)，在葉和莖中的表達(dá)量相對(duì)較高，其在葉中的表達(dá)量達(dá)到根中的25.21倍，推測(cè)該基因可能主要在菘藍(lán)的葉和莖中發(fā)揮表達(dá)調(diào)控作用。

2.3.2IiCYP79B2在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下的表達(dá)特性 分別考察IiCYP79B2基因在MJ、Glu、SA和低溫脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況，結(jié)果如圖8-C所示，IiCYP79B2的表達(dá)顯著響應(yīng)MJ和 Glu信號(hào)的誘導(dǎo)，分別在處理6，48 h后達(dá)到峰值，為對(duì)照的14.48，7.52倍。同時(shí)，IiCYP79B2的表達(dá)受到SA和低溫的明顯抑制，分別在低溫處理1，48 h后下降至對(duì)照水平的4.80%和8.32%。此外，IiCYP79B2基因?qū)A和MJ信號(hào)的響應(yīng)更為迅速和明顯。持續(xù)的低溫可能會(huì)對(duì)植株造成一定程度的損害，低溫脅迫處理后，IiCYP79B2基因的表達(dá)水平始終低于對(duì)照的表達(dá)水平；而MJ、Glu和SA處理72 h后，IiCYP79B2基因的表達(dá)量則基本都能夠恢復(fù)至與對(duì)照水平相當(dāng)。

3 結(jié)論與討論

芥子油苷參與十字花科植物與環(huán)境相互作用的過(guò)程，輔助植物適應(yīng)各種復(fù)雜環(huán)境，抵御各種生物與非生物脅迫，是該科植物中十分重要的一類次生代謝產(chǎn)物[8]。在芥子油苷的生物合成過(guò)程中，CYP79和CYP83家族發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能[12,17]。本研究首次克隆得到了菘藍(lán)IiCYP79B2基因，其編碼蛋白含有1個(gè)高度保守的血紅素結(jié)合域：FStGKRGCAA，屬于細(xì)胞色素P450家族；與芝麻菜(Erucasativa, AGM16417.1)、深山擬南芥(Arabidopsislyrata, EFH43155.1)和擬南芥(Arabidopsisthaliana, OAO99245.1)的氨基酸序列較為相似。IiCYP79B2在菘藍(lán)各組織部位中均有表達(dá)，且在葉中表達(dá)量最高，表現(xiàn)出一定的組織特異性。與擬南芥的CYP79B2基因在根中表達(dá)最高[18]，薺菜BjuCYP83A1基因在莖中表達(dá)量最高等研究結(jié)果存在不同[19]。此外，IiCYP79B2在萌芽期表達(dá)量較低，而后明顯上升，并在生長(zhǎng)期表達(dá)量達(dá)到最高，提示該基因的表達(dá)與菘藍(lán)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程存在一定的相關(guān)性，可能在菘藍(lán)的生長(zhǎng)期發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。由此可見(jiàn)，IiCYP79B2基因具有時(shí)空特異性，在不同的發(fā)育時(shí)期和組織部位的表達(dá)水平存在不同。

A.不同發(fā)育時(shí)期；B.不同組織部位；C.不同誘導(dǎo)子處理。不同小寫(xiě)字母代表相對(duì)表達(dá)量在0.05水平上差異顯著。

A.Different developmental stages;B.Different tissues; C.Different elicitors treatments.Different lowercase letters indicate significant differences for the relative expression at 0.05 levels.

圖8IiCYP79B2基因表達(dá)模式的研究
Fig.8 Study on expression pattern ofIiCYP79B2gene

本研究還進(jìn)一步探討了IiCYP79B2基因受不同脅迫處理后表達(dá)模式的變化情況，研究結(jié)果顯示，該基因的表達(dá)顯著響應(yīng)茉莉酸甲酯(MJ)和葡萄糖(Glu)信號(hào)的誘導(dǎo)，而受到水楊酸(SA)和低溫(4 ℃)脅迫的抑制。Mikkelsen等[20]用MJ處理擬南芥葉片后發(fā)現(xiàn)CYP79B2和CYP79B3的表達(dá)量分別增高了1.5，3.5倍，吲哚族芥子油苷的含量提高到原來(lái)的3～4倍，其中N-甲氧基吲哚-3-甲基芥子油苷的積累量更是達(dá)到對(duì)照組的10倍之多；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)MJ和SA在此過(guò)程中存在一定的拮抗作用。類似地，西蘭花中蘿卜硫素合成相關(guān)基因BoCYP83A1經(jīng)MJ處理后表達(dá)量升高了1.9倍，而SA處理后表達(dá)量則下降至對(duì)照的10%[21]。在本研究中MJ和SA同樣對(duì)菘藍(lán)IiCYP79B2基因的表達(dá)具有極為顯著的影響作用，且二者的作用也截然相反，這也與擬南芥中的研究結(jié)果較為一致[20]，二者之間是否存在拮抗作用還有待進(jìn)一步探討。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)低溫處理能夠明顯降低IiCYP79B2的表達(dá)量，這也與杜海等[22]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥在低溫處理后芥子油苷合成相關(guān)基因CYP79B2、CYP79B3、CYP83B1的表達(dá)量顯著降低的研究結(jié)果較為一致。由此可知，菘藍(lán)IiCYP79B2基因的表達(dá)顯著響應(yīng)MJ、Glu信號(hào)的誘導(dǎo)，而受到SA和低溫處理的抑制，相關(guān)研究結(jié)果與擬南芥、西蘭花中相應(yīng)基因的表達(dá)模式存在一定的相似之處，但也存在具體響應(yīng)模式的不同。

綜上，本研究首次克隆了菘藍(lán)IiCYP79B2基因，運(yùn)用各種在線軟件進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行了初步的探究。這些結(jié)果為進(jìn)一步探究該基因的生物學(xué)功能，深入解析菘藍(lán)中芥子油苷的合成和調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。