張 珊，郭啟平，劉媛媛，黨仁美，聞珊珊

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，小麥分子生物學(xué)與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

小麥(TriticumaestivumL.)是人類主要糧食作物之一，種植面積在谷物中占首位[1]。隨著全球水資源的短缺和氣候的變化，小麥的生長環(huán)境面臨著巨大的挑戰(zhàn)[2]，所以提高小麥的耐旱耐鹽性，對維持其可持續(xù)供應(yīng)有重大意義。因此，了解小麥的抗逆分子機(jī)制并應(yīng)用于實(shí)踐生產(chǎn)對于提高小麥的產(chǎn)量有重要的指導(dǎo)意義。水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)又叫水孔蛋白，以轉(zhuǎn)運(yùn)水分子而得名，是一種位于細(xì)胞膜上的內(nèi)在膜蛋白，通過對氣體、水、小分子溶質(zhì)和重金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)來提高植物的抗逆性[3]。小麥水通道蛋白的克隆及表達(dá)分析將會為小麥抗逆性研究提供理論基礎(chǔ)。

水通道蛋白分布十分廣泛，幾乎存在于動(dòng)植物各個(gè)組織器官以及生長發(fā)育的各個(gè)時(shí)期[4]，介導(dǎo)水分的運(yùn)輸并維持水分平衡[5]，參與細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)、生長分化及籽粒和根部的水分運(yùn)輸?shù)壬磉^程[6-8]。

根據(jù)水通道蛋白的序列同源性和結(jié)構(gòu)特征可以將其分為5個(gè)家族，即存在于質(zhì)膜上的質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(Plasma membrane intrinsic proteins, PIPs)、存在于共生根瘤菌體膜上的類似根瘤素26膜內(nèi)在蛋白(Nodulin 26-like intrinsic proteins，NIPs)、位于液胞膜上的液胞膜內(nèi)在蛋白(Tonoplast intrinsic proteins, TIPs)、 小分子堿性膜內(nèi)在蛋白(Small and basic intrinsic proteins, SIPs)以及未鑒定的膜內(nèi)在蛋白(Unclassified X intrinsic proteins, XIPs)[9]。而TIP1.1基因較高水平的轉(zhuǎn)錄能夠促進(jìn)小麥的線性蒸騰，利于水分和養(yǎng)分的吸收、運(yùn)輸[10]。

自從1992年分離出第一個(gè)水通道蛋白開始[11]，已經(jīng)在馬鈴薯[12]、水稻[13]、小麥[14]等多種植物中克隆并研究了AQPs的功能。液泡膜內(nèi)在水通道蛋白(TIPs)具有高效的透水性，透水效率達(dá)到質(zhì)膜水通道蛋白的100倍以上，能夠控制細(xì)胞的膨脹或緊縮，維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)環(huán)境[15]，對植物非生物脅迫有著很高的耐受性。在擬南芥中過表達(dá)PIP1基因增強(qiáng)了其耐旱和耐鹽性[16]。

目前TaAQP7、TaNIP4-1和TaTIP2[17-19]等水通道蛋白已經(jīng)在小麥非生物脅迫中報(bào)道過，而TaTIP1-4DL基因未見報(bào)道。本研究借助分子克隆及表達(dá)分析等手段分析該基因的生物學(xué)特征，研究其表達(dá)模式，以了解其作用機(jī)制，為小麥抗逆分子育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

供試材料中國春由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院518實(shí)驗(yàn)室提供。選取抽穗期小麥的旗葉置于-80 ℃冰箱備用，用于總RNA的提取。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國Roche生物公司；TaqDNA聚合酶來自TaKaRa公司；大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生物公司；TRIzol總RNA提取試劑、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒和T4DNA連接酶均購自上海生工生物工程技術(shù)公司；引物合成及測序由北京奧科鼎盛生物公司完成。

1.2 總RNA的提取與cDNA的合成

用TRNzol總RNA提取試劑提取小麥旗葉中的總RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的RNA質(zhì)量，用羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄出cDNA的第一鏈。

1.3 TaTIP1-4DL基因的克隆

以二穗短柄草TIP1(XP_003558815.1)的序列為探針?biāo)阉髁扼w小麥數(shù)據(jù)庫Ensembl Plants中相似序列，得到4D、4A、4B 3條相似度90%以上的拷貝，分別為TraesCS4D02G308800、TraesCS4A02G410800.1和TraesCS4B02G310900.1。用小麥表達(dá)量在線分析軟件Wheat Expression Browser(http://www.wheat-expression.com/)比較3條不同拷貝的表達(dá)量水平，選擇在小麥根、葉、籽粒中的表達(dá)量較高的4D染色體上的拷貝設(shè)計(jì)特異性引物(F-0：5′-CTTGGAGGTG ACCGAAAATG-3′；R-0：5′-GGAGACGATGACGAGAC GC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以小麥旗葉的cDNA為模板擴(kuò)增基因全長，PCR擴(kuò)增體系包括TaqDNA聚合酶0.25 μL，10×Buffer緩沖液5 μL，4 μL的dNTPs，1 μL的cDNA(100 ng/μL)模板，上下游引物(5 μmol/L)各1 μL，最后用水補(bǔ)足到50 μL終體積。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性3 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min。之后PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收電泳片段后連接于T載體，挑陽性克隆送楊凌奧科公司測序，重復(fù)3次，獲得基因序列。

1.4 生物信息學(xué)分析

將所得的TaTIP1-4DL基因的編碼蛋白用在線軟件ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行理化性質(zhì)的預(yù)測；運(yùn)用SignaIP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件分別對蛋白的信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；為了解TaTIP1-4DL蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，運(yùn)用SPOMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=np%20sa_sopma.html)和Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分別對蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)和3D模型的預(yù)測；運(yùn)用Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析TaTIP1-4DL基因的啟動(dòng)子；以TaTIP1-4DL蛋白質(zhì)序列為模板，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對得到不同物種的同源蛋白，使用DNAMAN軟件進(jìn)行TaTIP1氨基酸多序列比對和保守域分析，并使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建基于Neighbor-joining(Bootstrap值為1 000)的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.5 TaTIP1-4DL基因表達(dá)分析

為進(jìn)一步研究TaTIP1-4DL基因在小麥不同組織中的表達(dá)情況，分別提取抽穗期小麥根、莖、葉、潁殼、籽粒的總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用紫外分光光度儀檢測其濃度質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于該基因的組織特異性表達(dá)分析。選取小麥對水分最敏感的灌漿期對小麥進(jìn)行非生物脅迫[20]。將灌漿期的小麥分別置于含有100 μmol/L的ABA，20%的PEG和200 mmol/L的NaCl的水溶液中，并在0，3，6，9，12，24 h時(shí)分別取樣品的葉片和籽粒，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于ABA，干旱和鹽脅迫下的表達(dá)分析。設(shè)計(jì)特異性引物(F-1:5′-TACCAGTGGGTGTACTGGGT-3′；R-1:5′-TTAGT AGTCGGTGGTGGGGA-3′)為TaTIP1-4DL基因的定量引物，小麥Actin作為內(nèi)參，引物為Actin-F：5′-TA GATGCAGTAAAGAACCTGAC-3′；Actin-R：5′-GCCGT GGAGAAGAAGGATC-3′。RT-PCR反應(yīng)體系為：SYBR Mixture 10 μL， cDNA模板(100 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，最后用水補(bǔ)足到20 μL。用Roche LightCycler 480儀器進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，反應(yīng)重復(fù)40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。用公式2-ΔΔCT計(jì)算基因表達(dá)量，用SPSS對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，用Excel 2013作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaTIP1-4DL基因的克隆

利用特異性引物F-0和R-0對中國春旗葉的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50 μL的PCR產(chǎn)物分2個(gè)膠孔進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，得到大概760 bp的特異性條帶(圖1)。經(jīng)過膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選等分子試驗(yàn)，選取陽性克隆進(jìn)行搖菌、測序。測序結(jié)果與Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果顯示與4DL上的序列相似度達(dá)到100%，序列全長771 bp，將其命名為TaTIP1-4DL基因。

2.2 TaTIP1-4DL蛋白生物信息學(xué)分析

2.2.1 TaTIP1-4DL蛋白的理化性質(zhì)分析 利用ExPASy-ProtParam分析得到小麥TaTIP1-4DL蛋白的分子式為C1229H1889N299O329S；分子質(zhì)量為26.3 ku；理論等電點(diǎn)(PI)為6.82；不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)計(jì)算為25.48，為穩(wěn)定性蛋白；總親水性平均數(shù)為0.865，可以推測為疏水性蛋白。TaTIP1-4DL蛋白包括257個(gè)氨基酸，其中丙氨酸(Ala)占 13.2%，甘氨酸(Gly)占14.0%，纈氨酸(Val)占10.5%。

M.D2000plus DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-2.PCR產(chǎn)物。M.D2000plus DNA ladder；1-2.PCR products.

2.2.2 TaTIP1-4DL蛋白的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測 利用SignalP 4.1 Server在線軟件分析表明，TaTIP1-4DL蛋白不存在信號肽結(jié)構(gòu)。TMHMM的跨膜區(qū)預(yù)測表明：TaTIP1-4DL蛋白含有6個(gè)可能的跨膜區(qū)域， 為水通道蛋白的典型跨膜結(jié)構(gòu)。其中由內(nèi)向外跨膜的有17-39位，101-123位和173-195位氨基酸，由外向內(nèi)跨膜的有59-81位，138-160位和215-237位氨基酸(圖2)。

圖2 TaTIP1-4DL蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.2 Prediction of transmembrane domains of TaTIP1-4DL

2.2.3 TaTIP1-4DL蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測 SOPMA在線預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)表明，α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量較多，都占到36.96%，其次是β-片層占到20.23%，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)所占最少為5.84%。Phyre2進(jìn)行3D模型預(yù)測如圖3，模型的置信度達(dá)到100%，氨基酸序列的覆蓋度達(dá)到90%，因此，可以認(rèn)為該蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測是可靠的。從模型中可以看出該蛋白結(jié)構(gòu)為沙漏模型，包括6個(gè)貫穿兩面的長α螺旋和2個(gè)幾乎頂對頂放置的短α螺旋。

圖3 TaTIP1蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of three dimensional structure of TaTIP1 protein

2.2.4TaTIP1-4DL基因的啟動(dòng)子順式作用元件分析 啟動(dòng)子可以控制基因表達(dá)的起始和表達(dá)程度，是基因的重要組成部分，對啟動(dòng)子的元件進(jìn)行分析可以為更深入了解TaTIP1-4DL基因的功能奠定基礎(chǔ)。Plant CARE軟件對該基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明：該基因啟動(dòng)子區(qū)包含激素響應(yīng)元件例如脫落酸響應(yīng)元件(ABRE、ABRE3a、ABRE40)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(CGTCA-motif、 TGACG-motif)。脅迫響應(yīng)元件包括與干旱和鹽脅迫都相關(guān)的DRE元件和光響應(yīng)元件(G-Box、G-box、I-box、GF1-motif)。另外還包括胚乳特異性表達(dá)元件(GCN4-motif)。上述順式作用元件分析表明，植物激素與非生物脅迫可能影響TaTIP1-4DL基因的表達(dá)。

2.2.5TaTIP1-4DL基因氨基酸序列比對及進(jìn)化分析 通過DNAMAN軟件分析TaTIP1-4DL基因氨基酸序列與來自高粱(XP_002465859.1)、玉米(NP_001104896.1)、二穗短柄草(XP_003558815.1)和山羊草(XP_020178611.1)的TIP1氨基酸序列進(jìn)行多重比對，分析其保守區(qū)氨基酸序列。結(jié)果如圖4所示，所有參比物種的TIP1蛋白氨基酸序列相似度達(dá)到91.83%，其中小麥與山羊草的氨基酸序列最相似，可以達(dá)到93.0%。說明小麥中TIP1基因的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列具有高度同源性。另外，參比物種的氨基酸序列中都含有6個(gè)保守跨膜區(qū)和2個(gè)保守的NPA基序，這也是液泡膜內(nèi)在蛋白家族的典型特征[21]。

TM 1-6 代表6個(gè)跨膜區(qū)域；2個(gè)方框表示2個(gè)保守的NPA基序。TM 1-6 represented transmembrane domains；Two boxes respresent the two conserved NPA motifs.

利用MEGA 7.0繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示(圖5)，所有參比物種可以分為兩大類，木薯、番茄等雙子葉植物一類，小麥、玉米等單子葉植物一類。其中TaTIP1-4DL蛋白與山羊草的親緣關(guān)系最近，其次是黑麥草，二穗短柄草將三者聚類在一起。該進(jìn)化結(jié)果也與氨基酸比對的結(jié)果相符。

2.3 TaTIP1-4DL基因表達(dá)分析

對小麥根、莖、葉、籽粒、潁殼的表達(dá)分析顯示：TaTIP1-4DL基因在這5個(gè)組織中都有表達(dá)，但是表達(dá)水平存在差異。其中，在葉中的表達(dá)量最高，可以達(dá)到莖中的9.5倍，而根、潁殼、籽粒中的表達(dá)量沒有明顯的差別，可以得出該基因?yàn)榻M成型表達(dá)，且在葉中表達(dá)量較高。ABA、PEG和的NaCl的脅迫表達(dá)分析表明：小麥葉片和根組織中TaTIP1-4DL基因在脫落酸、干旱和鹽脅迫處理下的表達(dá)量的變化趨勢相似，都是先上升后下調(diào)。另外，葉子中TaTIP1-4DL基因的表達(dá)量變化比籽粒的明顯。脫落酸脅迫表明，在處理的第6小時(shí)葉和籽粒中基因的表達(dá)量都達(dá)到最高，之后隨著脅迫時(shí)間的增加逐漸下調(diào)。干旱脅迫結(jié)果表明，籽粒中TaTIP1-4DL基因的表達(dá)量也呈現(xiàn)先上升后下調(diào)的趨勢，但是葉中在處理后的第6小時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，為處理前的14倍，之后迅速下降，而后又有上升的趨勢。鹽脅迫的結(jié)果和ABA相似，表達(dá)量都是先上調(diào)后下調(diào)，且葉中的表達(dá)量在第6小時(shí)時(shí)達(dá)到最高(圖6)。以上分析表明，TaTIP1-4DL基因在ABA、干旱和鹽的脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)，這對提高小麥的抗逆性有重要作用。

圖5 小麥與其他物種TIP1蛋白的進(jìn)化分析Fig.5 Phylogene tree of TIP1 proteins from wheat and other species

不同小寫字母顯著差異(P<0.05 )。Significant difference in different lowercase letters (P<0.05).

3 結(jié)論與討論

水通道蛋白對水分子有高度選擇性，在促進(jìn)水分吸收和遠(yuǎn)距離運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)的功能是通過其結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)的，AQPs也不例外。本試驗(yàn)基于小麥數(shù)據(jù)庫克隆到TaTIP1-4DL基因，結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示TaTIP1-4DL蛋白也具有APQs典型的沙漏結(jié)構(gòu)，符合APQs的經(jīng)典結(jié)構(gòu)模型[22]。氨基酸比對結(jié)果顯示，TaTIP1-4DL蛋白也具有2個(gè)保守的NPA基序，6個(gè)典型的跨膜結(jié)構(gòu)域，說明水通道蛋白在進(jìn)化和結(jié)構(gòu)功能上具有一定的保守性。小麥和其他幾種植物TIP1相似蛋白的進(jìn)化樹分析表明，小麥的TIP1蛋白與山羊草、黑麥草、二穗短柄草具有高度同源性，表明該蛋白氨基酸序列可以作為植物分類的依據(jù)。

水通道蛋白的一個(gè)特征是在各個(gè)組織中普遍表達(dá)[23]，但在各個(gè)組織中的表達(dá)量會有差異。本試驗(yàn)對克隆出的TaTIP1-4DL基因做RT-PCR分析得出，TaTIP1-4DL基因?yàn)榻M成型表達(dá)，在小麥的各個(gè)組織中都有表達(dá)，這與前人在毛竹[24]、大麥[25]中對TIP1基因的表達(dá)分析結(jié)果一致。而TaTIP1-4DL基因在抽穗期的不同組織中葉子的表達(dá)量最高，這與TIP1在楊樹中的試驗(yàn)結(jié)果一致[26]。猜測這與TaTIP1基因?qū)λ值霓D(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，抽穗期的小麥，葉片細(xì)胞需要保持足夠的細(xì)胞膨壓用于孕育籽粒，相似的情況出現(xiàn)在玉米中[27]。現(xiàn)已有研究表明，水通道蛋白與正在生長或分裂的組織或器官的細(xì)胞擴(kuò)增呈正相關(guān)[10]。

植物應(yīng)對非生物脅迫時(shí)會通過細(xì)胞膨壓來維持體內(nèi)滲透平衡和離子平衡，降低外界因素帶來的傷害[28]，而TIP類蛋白負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。Plant CARE軟件預(yù)測TaTIP1-4DL基因的啟動(dòng)子內(nèi)含有與脅迫響應(yīng)相關(guān)的應(yīng)答元件，暗示該基因可能參與小麥的逆境脅迫。對小麥做進(jìn)一步的逆境脅迫表達(dá)分析，結(jié)果顯示：高濃度脫落酸、干旱、高鹽幾種脅迫方式都對TaTIP1-4DL基因在籽粒和葉片中的表達(dá)有不同程度的誘導(dǎo)，普遍遵循先上調(diào)后下降的趨勢。在葉片中的誘導(dǎo)程度普遍高于籽粒，并且脫落酸和干旱對TaTIP1-4DL基因表達(dá)的誘導(dǎo)較大。其他物種包括煙草[29]、水稻[30]、菜用大豆[31]等中都有關(guān)于對TIP1基因的相似脅迫研究。

本研究克隆出小麥TaTIP1-4DL基因，該基因編碼257個(gè)氨基酸，其蛋白結(jié)構(gòu)符合水通道蛋白的經(jīng)典結(jié)構(gòu)模型。組織特異性表達(dá)顯示該基因在各個(gè)組織中都有表達(dá)，為組成型表達(dá)。非生物脅迫表達(dá)分析顯示，脫落酸、干旱、高鹽都對TaTIP1-4DL基因有不同程度的誘導(dǎo)。該試驗(yàn)為TaTIP1-4DL基因在小麥非生物脅迫中的抗逆功能研究有一定實(shí)際意義，而其中的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。