王崇 楊新筍 雷劍 蘇文瑾 柴沙沙 張文英 王連軍

摘要：以抗病蟲相關基因SGT1作為靶標基因，設計出1條固定引物，與11條隨機引物組合。利用這11對引物對試驗材料鄂薯11和鄂紫薯13進行TRAP-PCR擴增，發(fā)現11對引物組合擴增出清晰條帶，且表現出良好的多態(tài)性。研究獲得與SGT1基因相關聯的TRAP標記，該標記可進行甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]群體的遺傳多樣性分析，為甘薯的抗病蟲育種提供理論依據。

關鍵詞：甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.];抗病蟲;SGT1基因;TRAP標記

中圖分類號：Q789;S531? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）17-0119-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.17.032? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Disease and pest resistance related gene SGT1 was used as a target gene to design a fixed primer，then for paring 11 pairs primers with 11 arbitrary primers. The 11 pairs of primers were used to amplify Eshu 11 and Ezishu 13 by TRAP-PCR. It was found that 11 pairs of primer combinations amplified clear bands and showed good polymorphism. In this study， TRAP markers associated with SGT1 gene were obtained， which can be used to analyze the genetic diversity of sweetpotato[Ipomoea batatas（L.） Lam.] population， and provide theoretical basis for disease and insect resistance breeding of sweetpotato.

Key words： sweetpotato[Ipomoea batatas（L.） Lam.]; disease and insect resistance; SGT1 gene; TRAP marker

甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]是世界上重要的糧食、飼料、工業(yè)原料及新型能源用塊根作物，中國是世界上最大的甘薯生產國，常年種植面積550萬hm2，鮮薯產量約1.2億t，分別占世界甘薯種植總面積和總產量的60%和85%[1]。甘薯在遺傳上高度雜合，種內、種間雜交不親和以及遺傳資源匱乏，遺傳基礎狹窄，病蟲害、病毒病危害嚴重，嚴重制約了甘薯品種的遺傳改良[2]。在目前的甘薯育種中，亟須開發(fā)出能夠與目標性狀或相關基因緊密連鎖的分子標記。

SGT1（Suppressor of the G2 allele of skp1）基因主要功能是調控著絲粒的裝配，并調節(jié)泛素對目標靶蛋白的修飾[3]。研究發(fā)現，SGT1基因發(fā)生沉默或基因突變，植物對R基因引起的病害抗性變弱，如果SGT1基因在植物體內過表達，則植物對病原微生物的抗性有所增強[4]。在植物體內，SGT1與HSP90（Heat shock protein，熱激蛋白90）和RAR1（Required for Mla12 resistance）形成復合體，在抗病信號轉導中扮演重要角色[5，6]。雖然抗病調控相關基因SGT1不是起著直接作用，但是它在植物抗病中占有不可或缺的地位[7]。SGT1對細菌、真菌、病毒和線蟲等病原均具有抗病反應，起到重要的調控作用[8-10]。

TRAP技術[11]是由SRAP技術[12]發(fā)展而來，具有簡單、高效、重復性好、效率高等優(yōu)點，已在菜豆[13]、小麥[14]、煙草[15]、棉花[16]等多種作物中得到了廣泛應用。本研究以抗病基因作為靶標基因，開發(fā)設計TRAP標記引物，旨在評價分析TRAP標記技術在甘薯研究中的利用價值，發(fā)掘出有效的與SGT1緊密連鎖的TRAP標記，為篩選甘薯抗病品種提供一定的理論依據，為甘薯抗病蟲遺傳改良奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料為高抗蔓割病、抗根腐病和莖線蟲病、感黑斑病的甘薯品種鄂薯11;感蔓割病、高感根腐病、中抗莖線蟲病、高感黑斑病的甘薯品種鄂紫薯13。通過海南和武漢兩地田間調查小象甲危害指數，鄂薯11受危害程度比鄂紫薯13輕。鄂薯11和鄂紫薯13種植于湖北省農業(yè)科學院糧食作物研究所試驗田。

1.2? 引物設計

利用Premier 5軟件設計引物。根據NCBI登錄號搜索到SGT1基因序列，以SGT1基因作為靶標基因設計1條固定引物，固定引物大小為18 bp，退火溫度為50 ℃，參考引用Li等[17]已發(fā)表的11條隨機引物（表1），均委托天一輝遠生物科技有限公司（武漢）合成。

1.3? DNA的提取

采取鄂薯11、鄂紫薯13的新鮮幼嫩葉片，采用改良CTAB法[18]提取甘薯總DNA。將DNA稀釋到PCR反應所需的濃度（50～60 ng/μL），在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4? TRAP反應體系和PCR擴增產物分析

使用S1000TM Thermal Cycler（BioRad）PCR擴增儀進行擴增，反應體系為：10×buffer（Mg2+）5.0 μL，dNTPs（10 mmol/L each）4.0 μL，固定引物1.0 μL，隨機引物1.0 μL，基因組 DNA（50～60 ng/μL）1.0 μL，Easy-Taq DNA Polymerase 0.5 μL，dd H2O補至總體積為50 μL;TRAP反應的PCR擴增程序為94 ℃預變性4 min;94 ℃變性45 s，35 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán);然后94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min，慢慢冷卻至10 ℃。PCR擴增產物在0.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）上電泳，105 V電泳4 h，銀染，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

2? 結果與分析

2.1? TRAP標記的多態(tài)性分析

使用11對TRAP引物對2個試驗材料進行分析，發(fā)現11對引物擴增片段主要集中在100～900 bp范圍內，每對引物組合可產生8～20條清晰、穩(wěn)定條帶，不同TRAP引物組合擴增出的帶型、條帶數量和分布均勻程度具有較大差異。11對引物組合均表現出多態(tài)性，產生的多態(tài)性條帶為4～10條，其中ST/me1、ST/me2、ST/em2、ST/em4等4對引物組合的多態(tài)性更為良好，可用于進一步分析研究（圖1）。

2.2? SGT1基因的TRAP分析

對11對引物組合擴增出的多態(tài)性條帶進行分析，主要集中在200～700 bp。鄂薯11與鄂紫薯13的抗性存在差異，發(fā)現某些條帶在鄂薯11中出現，而在鄂紫薯13中沒有產生條帶。如圖1箭頭所指，組合ST/me1在鄂薯11中擴增出3條特異性條帶，鄂紫薯13中沒有出現;引物組合ST/em2在鄂薯11中擴增出4條特異性條帶，而鄂紫薯13中沒有出現這4條特異性條帶。在這些多態(tài)性條帶中，可能存在SGT1基因的特異擴增條帶，這些片段可能與SGT1基因緊密相關。接下來可以對這些特異性片段進行回收、測序，做進一步的研究。

3? 小結與討論

通過基因克隆，發(fā)現SGT1基因在植物抗病中起到重要作用。李為民等[19]發(fā)現GbSGT1基因在海島棉的抗黃萎病中發(fā)揮著重要作用。當經過黃萎病菌誘導后，GbSGT1基因的轉錄水平表達量顯著提高。王凱等[20]研究發(fā)現，小麥體內SGT1基因的超量表達可以提高對黃矮病、白粉病的抗性。Xing等[21]將來自簇毛麥的SGT1基因導入普通小麥，發(fā)現對白粉病的抗性增強。蔣明等[22]以青花菜為試驗材料，發(fā)現霜霉菌和核盤菌誘導BoSGT1的過量表達，表明BoSGT1基因對霜霉菌和核盤菌具有抗性。Uppalapati等[23]發(fā)現，在抑制SGT1表達的情況下，在受丁香假單胞菌侵染時，番茄和擬南芥葉片出現失綠和細胞死亡等病癥。這些研究揭示了SGT1基因的多種抗病反應機制，為植物抗病基因工程的應用提供了更多的選擇。

TRAP技術的固定引物是基于EST序列設計的，是表達基因的一部分，因此通過開發(fā)與表型或目標基因連鎖的TRAP標記，被有效地應用于特定的基因定位。Miklas等[24]通過設計大豆的TRAP固定引物，在106個TRAP標記中有17個定位了與R基因相鄰的基因，2個調節(jié)灰莖枯萎病抗性，1個具有大豆花葉病毒抗性和共同的細菌抗性，證明TRAP標記具有標記抗病性基因的潛力。Saleh等[25]通過構建小麥Yecora Rojo和Pavon 76的F4群體，發(fā)現3個與葉綠素含量性狀相關聯的標記，4個與葉片衰老相關聯的標記和3個與葉片細胞膜穩(wěn)定性相關聯的標記，表明TRAP標記可以用于小麥的抗干旱育種。Chen等[26]結合SSR、SRAP和TRAP標記，發(fā)現了3個與小麥抗條銹病相關聯的標記，證實YrSph可能是一個新型的小麥抗條銹病基因。張娜等[27]將TRAP技術在小麥抗葉銹病基因中Lr24的分子標記中應用成功，得到1個與Lr24緊密連鎖的TRAP標記，可用于篩選抗葉銹病基因的群體。

甘薯小象甲是甘薯的一類重要病害，能造成甘薯的大面積減產[28]。研究發(fā)現SGT1和HSP90共同介導參與根線蟲、馬鈴薯蚜蟲和甘薯白蠅的抗性[29]，據此推測，SGT1基因可能也參與甘薯抗小象甲的調控。TRAP標記在種質資源的鑒定評價、遺傳圖譜構建、重要性狀基因標記、圖位克隆、cDNA與gDNA指紋分析等方面具有重要的應用價值[30，31]。本研究利用TRAP技術對鄂薯11和鄂紫薯13進行檢測，發(fā)現某些條帶在鄂薯11中出現，而在鄂紫薯13中無法檢測到，這些條帶可能與甘薯抗病和抗蟲基因有著緊密聯系，表明TRAP標記可能在甘薯的抗病和抗蟲遺傳改良中有著應用價值。

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