蔣 曦，趙應(yīng)征，俞雪鋒

(1. 浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，浙江 寧波 315000；2. 浙江大學(xué)明州醫(yī)院藥劑科，浙江 寧波 315000；3. 溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 浙江 溫州 325000)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是神經(jīng)系統(tǒng)最嚴(yán)重創(chuàng)傷之一。目前，已有很多促進(jìn)受損脊髓的修復(fù)策略，其中損傷處神經(jīng)的再生與修復(fù)尤為重要[1]。脊髓在損傷后具備軸突再生潛力，而損傷的軸突能否再生與其內(nèi)在因素和局部微環(huán)境均有關(guān)[2]。研究表明，多酚類化合物阿魏酸鈉(sodium ferulate，SF)，可改善SCI引起的運(yùn)動功能障礙[3]，且其機(jī)制涉及神經(jīng)保護(hù)與神經(jīng)再生作用。但SF需長期大劑量給藥才能達(dá)到療效，原因在于口服給藥不易透過血-脊髓屏障，導(dǎo)致其在應(yīng)用時出現(xiàn)瓶頸。近年來，人工合成高分子支架材料是目前治療SCI的研究熱點(diǎn)之一。

本實(shí)驗(yàn)通過建立SCI動物模型，以原位注射方式進(jìn)行分組給藥。通過觀察各組大鼠的運(yùn)動能力變化，比較SF溶液與SF肝素-泊洛沙姆(heparin-poloxamer hydrogels，HP)水凝膠制劑的療效，深入研究神經(jīng)修復(fù)相關(guān)蛋白(GAP43、GFAP、Nestin)的表達(dá)，進(jìn)一步探討SF作用機(jī)制。通過生物素葡聚糖胺(biotin dextran amine，BDA)示蹤法，論證SF-HP水凝膠制劑的療效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 ♂成年SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(浙)2015-0001。動物自由進(jìn)食、飲水。本實(shí)驗(yàn)涉及的動物實(shí)驗(yàn)符合1986年歐洲共同體理事會指導(dǎo)，并通過溫州醫(yī)科大學(xué)動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)。

1.1.2試劑 SF購于Sigma；膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(sc-33673)、生長相關(guān)蛋白(growth associated protein-43，GAP43)抗體(sc-33705)、Nestin抗體(sc-23927)，購于Santa Cruz；BCA試劑盒(P0012)，購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3儀器 Avanti-20XP型離心機(jī)(Beckman-Coulter)；IX70型倒置顯微鏡(日本Olympus)；WDT-V型腦立體定向儀(西安西北光電醫(yī)療器械廠)；電泳與轉(zhuǎn)膜設(shè)備、酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；GL-20C高速離心機(jī)(Thermo)；BMJ-Ⅲ型組織包埋機(jī)(常州中威電子儀器有限公司)；石蠟切片機(jī)(英國珊頓公司)；黏度計(jì)DV-I Prime(BROOKFIELD)。

1.2 方法

1.2.1SF-HP溫敏性水凝膠的制備 以夾心冷法制備SF-HP溫敏性水凝膠。稱取一定量的HP于西林瓶，加入含SF適宜濃度的去離子水，置4℃冰箱中過夜，使其充分吸水溶脹溶解，得到分散均勻、清澈澄明的SF-HP水凝膠溶液。

1.2.2水凝膠膠凝溫度的測定 采用攪拌法檢測凝膠膠凝溫度。西林瓶中放置不同濃度的HP，同時加攪拌子和精密溫度計(jì)，置于磁力攪拌器水浴加熱，轉(zhuǎn)速：100 r·min-1，保持水溶液持續(xù)緩慢升溫。當(dāng)其完全停止轉(zhuǎn)動時，溫度計(jì)顯示的溫度設(shè)定為膠凝溫度，每一樣品平行測定3次，結(jié)果取平均值。

1.2.3SF-HP水凝膠相轉(zhuǎn)變過程 將1 mL的SF-HP溶液置于流變儀中，其膠凝溫度為(38～40) ℃，頻率設(shè)定為1 Hz，應(yīng)變?yōu)?.05%，升溫范圍為(10～60) ℃，速率設(shè)為1 ℃·min-1。觀察凝膠彈性模量和黏性模量，將兩個模量相等時的溫度視為相轉(zhuǎn)變溫度[6]。

1.2.4SF-HP溫敏性水凝膠掃描電鏡 用液氮處理水凝膠樣品至固態(tài)，冷凍干燥48 h后噴金，然后在掃描電鏡下觀察水凝膠的形態(tài)[4]。

1.2.5實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、空白HP水凝膠組、SF溶液組、SF-HP水凝膠組，每組10只。在SCI手術(shù)后，SF溶液組經(jīng)原位注射方式給予SF(100 mg·kg-1)，SF-HP水凝膠組給予包載等量SF的水凝膠，空白水凝膠組給予HP水凝膠。依據(jù)相關(guān)研究，SF改善脊髓損傷的有效量為100 mg·kg-1，大鼠體質(zhì)量參照200 g，推算出給藥量為20 mg。大鼠在手術(shù)后1、3、7、14 d進(jìn)行運(yùn)動評分(Basso-Beattie-Bresnahan，BBB scale)和斜板實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)測試；d 14處死動物。

1.2.6大鼠脊髓損傷模型的建立[5]方法：注射戊巴比妥鈉30 mg·kg-1將SD大鼠麻醉，取俯臥位。暴露位于第8～9胸椎(T8～T9)和第9～10胸椎(T9～10)，在T9節(jié)段進(jìn)行椎板切除術(shù)打開椎管。采用血管動脈夾(30 g)夾閉脊髓2 min后將動脈夾取下，縫合肌層與皮膚，至動物完全蘇醒。

1.2.7BBB評分和斜板功能評分測試運(yùn)動能力[6]BBB評分：大鼠置于空曠場地，兩個觀察者對側(cè)站立觀察大鼠臀、膝、裸關(guān)節(jié)，行走，軀干運(yùn)動及協(xié)調(diào)情況。觀察時間：5 min，期間觀察者按評分標(biāo)準(zhǔn)(0～21分)進(jìn)行評分。

斜板功能評分：將大鼠置于Rivlin斜板上，從水平0°角位置開始，逐漸增大角度，在板上停留5s且不落下的最大角度視為評分結(jié)果。

1.2.8HE染色 乙醇梯度脫水后包埋切片，厚度4 μm。(63～65) ℃下烘片3～4 h，切片脫蠟水化，進(jìn)行蘇木精染色7 min。水洗后，乙醇分化5 s，伊紅染色2 min，乙醇脫水，二甲苯透明后封片。

1.2.9BDA順行神經(jīng)示蹤[7]術(shù)后14 d，戊巴比妥鈉麻醉后，將大鼠固定于腦立體定位儀，切開頭皮，確認(rèn)矢狀縫和冠狀縫，用微型鉆在以下8個點(diǎn)的位置鉆孔，第1～2個點(diǎn)在前囟前方2.7 mm，顱中縫左右2.5 mm；第3～4個點(diǎn)在前囟前方1 mm，顱中縫左右2.5 mm；第5～6個點(diǎn)在前囟后方0.4 mm，顱中縫左右1.5 mm；第7～8個點(diǎn)在前囟后方1.8 mm，顱中縫左右1.2 mm。鉆孔后，將10%濃度的BDA溶液注射入表面以下1、1.5、2.0 mm的深度，每個深度注射量為1.0 μL，注射時長2～3 min，留針5 min。2周后，取大鼠腰椎(L2)段處進(jìn)行冰凍切片。最后用熒光顯微鏡觀察BDA標(biāo)記的脊髓軸突再生情況，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.10免疫組化檢測GAP43、Nestin、GFAP表達(dá) 切片脫蠟脫水后，室溫靜置10 min；PBS洗滌后，置于枸櫞酸緩沖鹽溶液中，加熱至沸騰，放置5 min，PBS洗滌，加入BSA封閉液封閉20 min；吸去封閉液，PBS洗滌，加入一抗，常溫孵育2 h，PBS洗滌，加入二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌，進(jìn)行DAB顯色液30 s，洗滌后蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸乙醇分化3 s，沖洗返藍(lán)10 s，最終脫水、透明、封片。

1.2.11Western blot檢測GAP43、Nestin、GFAP表達(dá) 組織樣本中加入300 μL的細(xì)胞裂解液，勻漿離心取上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。電泳及轉(zhuǎn)膜后，封閉液封閉1 h，4 ℃孵育一抗12 h，TBST洗滌，二抗孵育1 h，洗滌后行曝光顯影，用薄層掃描分析儀分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 SF-HP水凝膠的制備與評價

2.1.1SF-HP水凝膠膠凝溫度的測定 SF-HP溫控型水凝膠制備過程中，HP濃度與膠凝溫度的變化關(guān)系如Fig 1A所示。HP濃度為17%時，SF-HP溫控型水凝膠的膠凝溫度在37 ℃，符合溫敏要求。

2.1.2SF-HP水凝膠相轉(zhuǎn)變過程 溫敏型水凝膠具有黏性液體和彈性固體的雙重特點(diǎn)，分別用彈性模量和黏性模量來衡量。如Fig 1B所示，17% SF-HP水凝膠在37 ℃時彈性模量與黏性模量相等，即顯示固體和液體形式量相等，為溫敏性水凝膠溫度達(dá)到相轉(zhuǎn)變溫度時的特征。當(dāng)溫度上升值超過相轉(zhuǎn)變溫度點(diǎn)時，再升高溫度，SF-HP水凝膠中彈性模量將發(fā)揮主要作用，溶液逐漸變凝膠。其彈性模量可達(dá)近10 kPa，說明制得的水凝膠已具理想力學(xué)強(qiáng)度。

2.1.3SF-HP水凝膠掃描電鏡結(jié)果 SF-HP水凝膠樣品在掃描電鏡下(Fig 1C)，呈多孔三維網(wǎng)絡(luò)狀立體結(jié)構(gòu)，且孔徑大小較均勻。

Fig 1 Characteristic of SF-HP hydrogels

A: Gelation temperature of HP hydrogels; B: Viscous modulus and elastic modulus of the HP hydrogels in PBS; C: SEM images of the surface morphology of the lyophilized SF-HP hydrogels;(a):×1 000;(b):×4 500.

2.2 SF-HP水凝膠對脊髓損傷后行為學(xué)的影響假手術(shù)組脊神經(jīng)功能正常，BBB評分為21分。脊髓損傷后，各組BBB評分均穩(wěn)定在0～1分間，說明動物模型成功建造，損傷較一致。SF給藥14 d后，治療組評分明顯高于SCI模型組(P<0.05)，SF-HP水凝膠給藥14 d后，與SF溶液組相比，評分升高更明顯(P<0.05)。斜板評分實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與BBB評分結(jié)果一致，給藥14 d后，SF治療組所測得的斜板角度與SCI組相比，明顯增加(P<0.05)；SF-HP水凝膠組評分與SF溶液組相比，明顯增加(P<0.05)。見Fig 2。

Fig 2 Motor function changes and improvement

A:BBB locomotion assessment on d 1, d 3, d 7, d 14 after SCI; B: The inclined plane test scores on d 1, d 3, d 7, d 14 after SCI.*P<0.05,**P<0.01vsSCI group;#P<0.05vsSF group.

2.3 SF-HP對脊髓損傷后HE病理學(xué)的影響Fig 3A為假手術(shù)組大鼠T8～T10段脊髓的HE染色鏡下的結(jié)果，脊髓組織結(jié)構(gòu)正常，白質(zhì)中神經(jīng)纖維走向平行一致，且具一定的連續(xù)性；灰質(zhì)中，神經(jīng)元形態(tài)良好、分布均勻。Fig 3B顯示了造模后14 d，模型組大鼠受損脊髓內(nèi)部出血，結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)組織水腫。HP處理組脊髓損傷程度與模型組相似，表明HP單獨(dú)給藥無明顯療效(Fig 3C)。在給予SF溶液14 d后，脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元略有增加，白質(zhì)中的神經(jīng)纖維排列具有一定的方向性，但排列仍然紊亂，但灰質(zhì)中神經(jīng)元數(shù)量不多(Fig 3D)；相比于SF溶液組，給予SF-HP水凝膠14 d后，脊髓修復(fù)狀態(tài)良好，灰質(zhì)白質(zhì)界限較為清晰，神經(jīng)細(xì)胞明顯增多，神經(jīng)纖維排列整齊，空洞狀有明顯改善(Fig 3E)。

Fig 3 HE staining(40× and 200×) 14 days after SCI

2.4 BDA順行神經(jīng)示蹤如Fig 4所示，BDA神經(jīng)示蹤后，經(jīng)過免疫熒光染色，脊髓中陽性的神經(jīng)元有綠色熒光。假手術(shù)組正常功能的脊髓具有明顯的綠色熒光；模型組不顯示熒光，BDA陽性細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組相比明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，SF治療組出現(xiàn)綠色熒光，BDA陽性細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)；與SF溶液組相比，SF-HP水凝膠組的BDA陽性細(xì)胞數(shù)更多(P<0.05)。

Fig 5 Immunohistochemical staining results of GAP43, Nestin and GFAP 14 days after SCI(400x)

2.5 SF-HP對脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5.1免疫組織化檢測 為深入研究SF-HP對脊髓損傷修復(fù)作用的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化檢測了GAP43、Nestin、GFAP的表達(dá)。Fig 5結(jié)果表明，假手術(shù)組未損傷的脊髓Nestin、GFAP、GAP43蛋白表達(dá)較少，模型組損傷14 d后，Nestin、GAP43、GFAP蛋白表達(dá)增加。給予SF治療14 d后，Nestin和GAP43表達(dá)增加明顯，GFAP表達(dá)減少。給予SF-HP水凝膠14 d后，觀察到相似結(jié)果。由于在定性分析中無法比較SF-HP水凝膠與SF溶液對相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，因此，采用Western blot進(jìn)行定量研究。

2.5.2Western blot檢測 如Fig 6所示，術(shù)后模型組大鼠脊髓的GFAP表達(dá)與假手術(shù)組相比明顯增加(P<0.01)，Nestin、GAP43表達(dá)無明顯變化。給予SF治療后，GFAP明顯降低(P<0.05)，而Nestin、GAP43表達(dá)增加(P<0.05)；與SF溶液組相比，SF-HP水凝膠組GFAP表達(dá)下降更為明顯(P<0.05)，同時，Nestin、GAP43表達(dá)增加更為明顯(P<0.05)。

3 討論

脊髓損傷后的神經(jīng)細(xì)胞死亡是主要源于繼發(fā)性損傷，因?yàn)閾p傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞被大量激活，形成反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，抑制營養(yǎng)因子的表達(dá)，同時上調(diào)抑制軸突生長相關(guān)蛋白的表達(dá)，阻礙受損神經(jīng)元的修復(fù)和再生。SF具有抗神經(jīng)凋亡作用[8]，研究發(fā)現(xiàn)，SF能改善脊髓損傷引起的運(yùn)動功能障礙[2-3]，并且發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)。但SF療效不佳，主要原因在于傳統(tǒng)給藥方式的局限，導(dǎo)致藥物無法達(dá)到損傷部位。

Fig 6 Effect of SF-HP on expression of GAP43,Nestin, GFAP in spinal cord of

A: Blots of GAP43, Nestin, GFAP expression in five groups; B: Analysis results of Western blot.**P<0.01vssham group;#P<0.05vsSCI group;△P<0.05vsSF group

本實(shí)驗(yàn)采用新型合成材料HP包載SF，制備SF-HP水凝膠。該材料具有以下特點(diǎn)[9]：① 適于人體應(yīng)用的相變溫度，可以在室溫時呈液體狀態(tài)，在人體溫度(37℃)時迅速形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)水凝膠，并保持較好的浸潤性；② 保持較好的抗凝活性，有利于防止神經(jīng)瘢痕和周圍血栓的形成。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HP適宜濃度為17%的SF-HP水凝膠，膠凝溫度符合要求。通常水凝膠在成凝膠態(tài)后彈性模量可達(dá)10 000 Pa左右，表明水凝膠具備一定的抗力性，與黏性模量占主要地位的溶液態(tài)相比，力學(xué)強(qiáng)度發(fā)生巨變。制得的SF-HP水凝膠已經(jīng)符合這一點(diǎn)，為體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中支撐細(xì)胞生長，促進(jìn)組織修復(fù)奠定基礎(chǔ)。凝膠具有明顯的多孔狀三維結(jié)構(gòu)，微觀結(jié)構(gòu)顯示其能在受損脊髓部位起到良好支撐作用，孔徑大小均一的特點(diǎn)也適宜包載治療藥物，符合本研究的需求。

實(shí)驗(yàn)通過行為學(xué)研究，比較SF溶液與SF-HP水凝膠的療效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SF-HP水凝膠組療效明顯優(yōu)于SF溶液組，并且給藥后7 d就能觀察到行為學(xué)的變化。而在給藥14 d，HE染色發(fā)現(xiàn)，SF-HP水凝膠組能更好地改善損傷后的脊髓內(nèi)部出血、組織水腫及脊髓結(jié)構(gòu)空洞化。這一結(jié)果也印證SF確實(shí)具有改善脊髓損傷的作用，同時本研究結(jié)果也表明，SF-HP水凝膠能明顯提高修復(fù)損傷脊髓的療效。

確認(rèn)神經(jīng)損傷后是否具有再生能力，依靠行為學(xué)評價和病理學(xué)初步評價尚不完整的，故采用BDA順行神經(jīng)示蹤技術(shù)，以更直觀的角度觀察神經(jīng)軸突的修復(fù)和再生情況。BDA是研究神經(jīng)功能變化的示蹤劑，可被神經(jīng)元攝取，并沿軸突轉(zhuǎn)運(yùn)，具有較好的穩(wěn)定性[10]。示蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SF-HP水凝膠組大鼠腰椎(L2)段處有較強(qiáng)的綠色熒光，與正常組大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)功能無明顯差異，并且熒光明顯強(qiáng)于SF溶液組，表明經(jīng)水凝膠包載的SF顯示出優(yōu)越的促受損脊神經(jīng)軸突再生修復(fù)的能力，明顯增強(qiáng)大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)功能。

脊髓損傷的恢復(fù)主要依賴于神經(jīng)元軸突的修復(fù)與再生，而軸突再生受到多方面的影響，本實(shí)驗(yàn)通過對脊髓損傷神經(jīng)修復(fù)通路的相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測，初步揭示SF-HP水凝膠增強(qiáng)脊髓神經(jīng)功能重建的機(jī)制。損傷后產(chǎn)生的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)元軸突再生的主要障礙，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活成為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞[11]。激活后的細(xì)胞發(fā)生改變，在損傷部位附近表達(dá)標(biāo)志性的蛋白，改變損傷部位及其周邊的微環(huán)境，抑制神經(jīng)元生長及軸突再生，這是阻礙神經(jīng)元軸突再生的主要因素[12]。Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞所特有的一種中間絲蛋白[13]；GAP43是神經(jīng)生長相關(guān)類蛋白，在生長、分化和再生等各個階段的軸突以及突觸中含量極高，其表達(dá)可以反映神經(jīng)軸突的生長及再生情況[14]；GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異蛋白，可分析星形膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓損傷中的增生情況[15]。通過對以上蛋白進(jìn)行免疫組化染色實(shí)驗(yàn)與蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SF-HP水凝膠可以在脊髓損傷修復(fù)進(jìn)程中，促GAP43和Nestin的表達(dá)，使神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量增多，促使其分化生長，減少神經(jīng)細(xì)胞中膠質(zhì)的含量，逆轉(zhuǎn)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致的神經(jīng)損傷。同時降低GFAP，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，阻止反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的生成。加之溫敏優(yōu)勢，使其在體內(nèi)溫度下迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)，包載的SF與脊髓損傷部位產(chǎn)生良好接觸，減少藥物的流失和不良反應(yīng)的發(fā)生，結(jié)合凝膠制劑緩慢釋放藥物的作用，使SF在受損脊髓周圍得以長久停留，促進(jìn)藥物減少膠質(zhì)瘢痕的形成，增強(qiáng)軸突再生的作用，利于對損傷脊髓的修復(fù)。

綜上所述，本研究從行為學(xué)、病理學(xué)、電鏡微觀形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)多角度綜合評價了SF-HP溫敏型水凝膠對脊髓損傷的治療作用，論證了HP溫敏型水凝膠對SF療效的增強(qiáng)作用，同時揭示了SF改善脊髓損傷的作用涉及神經(jīng)營養(yǎng)機(jī)制與膠質(zhì)瘢痕的抑制。