王劍飛，李理，李寶磊，周晴晴，陳蘇，陳麗娥

(1.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院哈爾濱150028；2.杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司食品科學(xué)研究院生物工程研究所，浙江省食品生物工程重點實驗室，杭州310018)

0 引言

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是廣泛被認(rèn)為是安全的一類微生物。乳酸菌在乳中的生長依賴于自身的蛋白水解系統(tǒng)降解乳蛋白來滿足自身的生長需求[1]。乳酸菌產(chǎn)蛋白酶的性質(zhì)對發(fā)酵乳的品質(zhì)有重要影響，應(yīng)用到發(fā)酵食品中，可以提高原料的酶解能力，產(chǎn)生許多風(fēng)味物質(zhì)前體和功能性成分—游離氨基酸，是篩選性質(zhì)優(yōu)良、穩(wěn)定性強(qiáng)的工業(yè)生產(chǎn)菌株的主要指標(biāo)[2]。支鏈氨基酸（branched am ino acid，BCAA），包括三種必需氨基酸，分別是亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，在人體中不能合成，需從食物中獲得。越來越多的證據(jù)表明，長時間的耐力運(yùn)動主要是BCAA參與供能[3]。BCAA還可以促進(jìn)運(yùn)動中乳酸菌-葡萄糖循環(huán)以及糖異生的作用[4]，有利于減少骨骼肌中乳酸積累，延緩疲勞發(fā)生和促進(jìn)運(yùn)動后疲勞的消除[5]。

乳清蛋白是干酪加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品，以其易消化吸收、氨基酸組成合理、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點被稱為“蛋白之王”[6]。乳清蛋白中BCAA含量較酪蛋白豐富，本研究在前期篩選獲得一株高產(chǎn)蛋白酶的德氏乳桿菌乳亞種菌株的基礎(chǔ)上，將其應(yīng)用于發(fā)酵乳清蛋白，并研究了不同發(fā)酵時間BCAA的變化情況。獲得的富含BCAA的發(fā)酵乳清蛋白液可作為運(yùn)動飲料、發(fā)酵乳制品的功能性配料，提高產(chǎn)品附加值，具有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MRS液體培養(yǎng)基20.0 g葡萄糖，22.5 g胰蛋白胨，5.0 g乙酸鈉，2.0 g檸檬酸二銨，0.58 g硫酸鎂，2.37 g三水磷酸氫二鉀，0.28 g一水硫酸錳，0.5 g半胱氨酸，1.0 g吐溫-80，蒸餾水定容至1 000 m L，調(diào)節(jié)pH值至5.8，121℃高壓滅菌15 m in；改良MRS固體培養(yǎng)基，在液體培養(yǎng)基中添加1.5%的瓊脂，脫脂乳粉、全脂乳粉、脫鹽乳清粉（D 90）（恒天然（中國）有限公司）；濃縮乳清蛋白（丹麥ARLA乳品公司）；堿性蛋白酶2.4 L、風(fēng)味蛋白酶Flavorzyme 1000L（諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司）。

恒溫培養(yǎng)箱（德國賽默飛世爾科技公司）；M u ltitron Standard通用型震蕩培養(yǎng)箱（伊孚森生物技術(shù)（中國）有限公司）；M inifors Bacteria實驗室臺式標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵罐（伊孚森生物技術(shù)（中國）有限公司）；O ptim aTM XPN超速離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Christ真空冷凍干燥機(jī)（北京博勵有限公司）；氨基酸分析儀（安捷倫科技（中國）有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)蛋白酶乳酸菌菌株

本研究所用菌株為實驗室自主分離于西藏山區(qū)當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶自制傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，經(jīng)篩選得到的一株具有較高蛋白分解能力的德氏乳桿菌乳亞種（下稱LB815）。該菌株現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號為CGM CC N o.13750。

1.2.2 菌株高密度發(fā)酵條件確定

對培養(yǎng)基中碳源、氮源、發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH值、通氣種類進(jìn)行確定。

1.2.3 活菌數(shù)檢測

對發(fā)酵后的菌懸液直接進(jìn)行生理鹽水梯度稀釋，并涂布于MRS固體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，選擇菌落數(shù)為30～300的稀釋梯度進(jìn)行計數(shù)。

1.2.4 高活性凍干菌粉制備

采用改良M RS液體培養(yǎng)基對菌株LB815進(jìn)行活化與傳代（37℃，培養(yǎng)12 h），所得培養(yǎng)物經(jīng)梯度稀釋后涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)至有單菌落形成，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取單菌落至10 m L M RS改良液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h，所得培養(yǎng)物1%（體積比）接種至50 m L MRS改良液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h，所得培養(yǎng)物1%（體積比）接種至200 m L MRS改良液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h后將所得培養(yǎng)物全部接種于發(fā)酵罐中，37℃，恒定pH值（氨水調(diào)節(jié)）發(fā)酵18 h（對數(shù)生長后期）。發(fā)酵液8 000 r/m in，離心10 m in，收集菌泥，菌泥與保護(hù)劑按一定比例混勻后倒入平皿，至凍干機(jī)進(jìn)行凍干。獲得的凍干菌粉進(jìn)行活菌計數(shù)，并密封保存于-30℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 發(fā)酵乳清蛋白液

配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的乳清蛋白溶液，均質(zhì)后冷卻至43℃，接入LB815菌粉，調(diào)整活菌數(shù)為3.0×106cfu/m L，43℃靜止發(fā)酵24 h。4℃保存，檢測氨基酸含量，并進(jìn)行感官評價。

1.2.6 氨基酸含量檢測

樣品前處理：準(zhǔn)確稱量發(fā)酵乳樣品2.5 g，10%磺基水楊酸（0.02m o l/L HC l配置）定容至10 m L，室溫靜置10 m in后，取2 m L離心，離心得上清0.22 um有機(jī)濾膜處理后，待上機(jī)檢測。色譜條件及數(shù)據(jù)分析參考文獻(xiàn)方法[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株

菌株LB815在M RS固體培養(yǎng)基上可形成圓形、邊緣整齊的半透明菌。菌懸液在乳清蛋白水瓊脂平板上可形成明顯的水解圈，且水解圈直徑大于其他菌株，說明該菌株對乳清蛋白有較強(qiáng)分解能力[8]。

2.2 培養(yǎng)基中碳、氮源對菌株LB815生長的影響

根據(jù)前期API50實驗結(jié)果，以菌株LB815可利用的糖，分別為蔗糖、葡萄糖、海藻糖、果糖、乳糖和麥芽糖為碳源發(fā)酵，其他成分同M RS液體培養(yǎng)基。取菌懸液稀釋涂布，計活菌數(shù)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 碳源對LB815生長的影響

以果糖為碳源，牛肉浸粉、酵母粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨單體或復(fù)配（單體較好的兩種）為氮源，其他成分同MRS液體培養(yǎng)基。取菌懸液稀釋涂布，計其活菌數(shù)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 氮源對LB815生長的影響

2.3 發(fā)酵溫度對菌株LB815生長的影響

設(shè)定發(fā)酵溫度為34、37、40、43℃，以果糖為碳源，牛肉浸粉和大豆蛋白胨為復(fù)合氮源，通N2，150 r/m in攪拌，pH值為5.5，進(jìn)行發(fā)酵。取菌懸液稀釋涂布，計活菌數(shù)，結(jié)果如圖3所示。

2.4 發(fā)酵p H值對菌株LB815生長的影響

設(shè)定發(fā)酵控制p H值為5.0、5.5、6.0、6.5，溫度為37℃，以果糖為碳源，牛肉浸粉和大豆蛋白胨為復(fù)合氮源，通N2，150 r/m in攪拌進(jìn)行發(fā)酵。取菌懸液稀釋涂布，計活菌數(shù)，結(jié)果如圖4所示。

圖3 發(fā)酵溫度對LB815生長的影響

圖4 發(fā)酵pH值對LB菌株815生長的影響

2.5 通氣種類對菌株LB815生長的影響

設(shè)定通氣種類分別為不通氣、CO2、N2，溫度為37℃，以果糖為碳源，牛肉浸粉和大豆蛋白胨為復(fù)合氮源，150 r/m in攪拌進(jìn)行發(fā)酵。取菌懸液稀釋涂布，計活菌數(shù)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 通氣種類對LB815生長的影響

綜合以上結(jié)果，菌株LB815高密度培養(yǎng)條件為：果糖為碳源、牛肉浸粉和大豆蛋白胨為復(fù)合氮源、發(fā)酵溫度37℃、pH值恒定為5.5、通氮?dú)?。該發(fā)酵條件下，菌懸液活菌數(shù)為2.63×109cfu/m L，冷凍干燥后菌粉活菌數(shù)為2.93×109cfu/m L。

2.6 BCAA含量隨發(fā)酵時間變化情況

發(fā)酵過程中取樣檢測BCAA和總游離氨基酸含量，如圖6所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從發(fā)酵5 h開始積累BCAA至26 h達(dá)到最高值，隨后緩慢下降。3種氨基酸的組成，以亮氨酸最多，纈氨酸次之，異亮氨酸最少，BCAA總量最高可達(dá)到312.55 m g/kg。關(guān)于通過乳酸菌發(fā)酵乳清蛋白獲得BCAA的相關(guān)報道較少，王豪[9]等人，以生牛乳混合分離乳清蛋白為基料，發(fā)酵乳桿菌PCC為發(fā)酵菌種制備的發(fā)酵乳飲料中BCAA的含量僅為73.2 m g/kg。

圖6 BCAA隨發(fā)酵時間變化情況

3 結(jié)論

產(chǎn)蛋白酶的乳酸菌是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌種，本研究對一株高產(chǎn)蛋白酶的德氏乳桿菌乳亞種LB815的高密度發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化和確定，為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論數(shù)據(jù)支撐。同時，將該菌株應(yīng)用于發(fā)酵乳清蛋白，并考察不同發(fā)酵時間功能性成分—支鏈氨基酸含量的變化情況，為今后相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。