秦 臻 李正淼 秦 漢 姜亨波 陳 微 石運芝

1.口腔醫(yī)學(xué)院； 2.動脈粥樣硬化研究所，山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016

牙菌斑(dental plaque)是在所有人口腔中都存在的一種由口腔微生物群落組成的生物膜結(jié)構(gòu)[1]。人類口腔中存在著結(jié)構(gòu)復(fù)雜的微生物菌群，它們在宿主口腔健康狀況方面起著重要作用?？谇患膊?如齲齒，牙齦炎，牙周炎等)是由于牙菌斑中的微生物之間以及微生物與宿主之間的生態(tài)平衡被打破而發(fā)展成的。了解口腔牙菌斑中微生物的種類對恢復(fù)口腔內(nèi)生態(tài)平衡，治療與預(yù)防口腔疾病有重大意義[2-3]?？谇患膊〉难芯看蠖嘁游锬Ｐ筒拍苓M(jìn)行，由于動物與人類的口腔始終存在一定的差別以及口腔疾病致病機制的復(fù)雜性，很難確定一個完美的動物模型來完全模擬人類口腔疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。而且由于不同實驗動物的差別，所建造的動物模型中牙菌斑的微生物組成會有差別，這些都會對實驗結(jié)果造成影響[4]。有研究表明，小型豬、大鼠、人類口腔內(nèi)微生物構(gòu)成比之間存在差異[5]。因此，在進(jìn)行口腔疾病相關(guān)研究之前，研究者不僅要熟悉人類口腔牙菌斑中微生物種類，更要明確實驗動物口腔牙菌斑中微生物種類。通過分離、培養(yǎng)、鑒定實驗動物口腔牙菌斑中微生物種類，與人類作對比，可以對有關(guān)口腔疾病防治的相關(guān)研究提出更準(zhǔn)確的意見與建議。相比其他動物，鼠科的動物較溫順，飼養(yǎng)成本和生長所需空間小，并且有大量學(xué)者采用鼠科動物進(jìn)行口腔相關(guān)疾病的研究，曾有研究者在倉鼠口內(nèi)提取到雙歧桿菌[6]。所以此次實驗我們主要在健康成年Wistar雄性大鼠口內(nèi)建立菌斑模型，對其牙菌斑細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)與鑒定，為選擇適合人類口腔微生物和疾病研究的模型動物，建立實驗動物菌斑模型、齲病模型，研究齲病防治方法等提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年Wistar雄性大鼠24只，質(zhì)量(220±20)g，購自濟(jì)南朋悅公司，常規(guī)飼養(yǎng)，通風(fēng)清潔，光照12 h，適應(yīng)1周后開始實驗。

1.2 實驗試劑

腦心浸出液肉湯(brain heart infusion broth，BHI；青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司)、MSA培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)、TPY瓊脂培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)、菌斑染色劑-堿性品紅(日進(jìn)齒科材料有限公司)、結(jié)晶紫染液、碘液、95%酒精、稀釋復(fù)紅、香柏油、Trans2K DNA Marker、Mix、上游與下游引物(表1)、ddH2O、BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10(上海微科生物技術(shù)有限公司)、50×TAE緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)、核酸凝膠染料試劑gelred(北京索萊寶科技有限公司)和瓊脂糖等。

表1 上下游引物

1.3 實驗步驟

1.3.1菌斑模型的建立

用普通顆粒飼料和60%高糖水飼喂健康成年Wistar雄性大鼠。20天后，用菌斑染色劑檢測大鼠磨牙舌面與牙合面菌斑的形成情況。

1.3.2牙菌斑的采集與細(xì)菌的分離鑒定

用無菌棉棒在牙合面窩溝點隙采集牙菌斑，涂布在MSA培養(yǎng)基與TPY瓊脂培養(yǎng)基上，37℃ 恒溫箱(天津泰斯特儀器有限公司101-3AB型)中培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)。

用接種環(huán)分別挑取MSA培養(yǎng)基與TPY瓊脂培養(yǎng)基中的優(yōu)勢菌落，接種在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(以下稱血瓊脂培養(yǎng)基)上進(jìn)行純培養(yǎng)，37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)。隨后將血瓊脂培養(yǎng)基上的菌落接種于腦心浸出液肉湯(以下稱BHI增菌液)，37℃BS-1E恒溫震蕩培養(yǎng)箱(常州市金壇友聯(lián)儀器研究所)中增菌48 h。

1.3.3革蘭氏染色

在潔凈的玻片中間加生理鹽水1滴。接種環(huán)燒灼滅菌后，取血瓊脂培養(yǎng)基中細(xì)菌培養(yǎng)物與生理鹽水混勻，涂成直徑1 cm的均勻薄膜涂片。然后按照順序滴加結(jié)晶紫染液、革蘭碘液、95%酒精、稀釋復(fù)紅染液，每兩個步驟之間需用水沖洗玻片。最后晾干，滴加香柏油，用油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。燒去接種環(huán)上多余的菌體后，再取另一細(xì)菌培養(yǎng)物重復(fù)上述步驟[8]。

1.3.416S rRNA基因擴(kuò)增和測序

取增菌液500 μL加入離心管內(nèi)，12 000 r/min離心1 min，棄去上清液；加入500 μL dd H2O洗滌2次，離心后棄掉上清液。隨后離心管內(nèi)加入40 μL dd H2O，混勻，98℃水浴加熱30 min，冷卻，瞬時離心，上清液中即含細(xì)菌DNA，可用于16S rRNA基因擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增的總反應(yīng)體積為25 μL，依次加入Mix 12.5 μL，dd H2O 10.5 μL，DNA提取液1 μL，引物27F 0.5 μL，引物1492R 0.5 μL，瞬時離心混勻。在Applied BiosystemsTMVeritiTM96-Well Thermal Cycler 熱循環(huán)儀中，反應(yīng)按95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min[9]。

將擴(kuò)增產(chǎn)物一部分在DYY-6D電泳儀(北京市六一儀器廠)中進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像儀(BIO RAD UNIVERSAL HOOD)觀察，拍照，記錄結(jié)果；另一部分送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中使用BLAST軟件進(jìn)行序列比對分析。16S rRNA序列同源性大于99%提示屬于同一種細(xì)菌。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 牙菌斑形成情況

在大鼠磨牙牙合 面窩溝內(nèi)可見指示劑著色，表明此處有菌斑形成,見圖1。

圖1 大鼠牙合面菌斑染色結(jié)果

2.2 細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的生長情況

在血瓊脂、BHI和MSA培養(yǎng)基中共分離得到3種不同菌落形態(tài)的細(xì)菌，分別標(biāo)記為1、2和3號。

1號細(xì)菌在血瓊脂培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基與MSA培養(yǎng)基上呈完整的乳膏樣或白色的圓形菌落，面積較大，表面光滑濕潤，邊緣整齊，見圖2(A)、(D)、(G)。細(xì)菌在血瓊脂培養(yǎng)基中不溶血且生長情況最好，BHI培養(yǎng)基和MSA培養(yǎng)基的菌落直徑明顯小于血瓊脂培養(yǎng)基，BHI培養(yǎng)基的菌落直徑明顯小于MSA培養(yǎng)基,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2號細(xì)菌在BHI與MSA培養(yǎng)基上呈半透明狀，是圓形突起、表面粗糙、邊緣整齊的針尖樣大小菌落，見圖2(E)、(H)；在血瓊脂培養(yǎng)基中為直徑1 mm大小半透明狀菌落，不溶血且生長情況最好，見圖2(B)。菌落直徑統(tǒng)計結(jié)果顯示，BHI培養(yǎng)基和MSA培養(yǎng)基的菌落直徑明顯小于血瓊脂培養(yǎng)基，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

3號細(xì)菌在血瓊脂培養(yǎng)基與BHI培養(yǎng)基上表現(xiàn)為直徑1～2 mm的圓形灰白色菌落，表面光滑濕潤，邊緣整齊，見圖2(C)、(F)；在MSA培養(yǎng)基上，呈直徑3～4 mm的半透明狀菌落，生長情況最好，見圖2(I)。菌落直徑統(tǒng)計結(jié)果顯示，血瓊脂培養(yǎng)基和BHI培養(yǎng)基的菌落直徑明顯小于MSA培養(yǎng)基，BHI培養(yǎng)基的菌落直徑明顯小于血瓊脂培養(yǎng)基，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的菌落直徑(mm)

注：同一列中上標(biāo)不同小寫字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。

A.血瓊脂培養(yǎng)基上1號細(xì)菌生長情況；B.血瓊脂培養(yǎng)基上2號細(xì)菌生長情況；C.血瓊脂培養(yǎng)基上3號細(xì)菌生長情況；D.BHI培養(yǎng)基上1號細(xì)菌生長情況；E.BHI培養(yǎng)基上2號細(xì)菌生長情況；F.BHI培養(yǎng)基上3號細(xì)菌生長情況；G.MSA培養(yǎng)基上1號菌落生長情況；H.MSA培養(yǎng)基上2號菌落生長情況；I.MSA培養(yǎng)基上3號菌落生長情況

圖2 細(xì)菌在不同培養(yǎng)基上的生長情況

2.3 革蘭氏染色結(jié)果

革蘭氏染色結(jié)果顯示3種細(xì)菌染色后都為紫色，提示它們都為革蘭氏陽性菌。1號細(xì)菌為圓形或橢圓形，成對或短鏈?zhǔn)缴L，見圖3(A)。2號細(xì)菌呈細(xì)長桿狀，中等大小，多數(shù)單個分布，少數(shù)成對分布,見圖3(B)。3號細(xì)菌為圓形或橢圓形，鏈狀排列，長短不一,見圖3(C)。

A.1號細(xì)菌；B.2號細(xì)菌；C.3號細(xì)菌

2.4 16S rRNA基因擴(kuò)增和測序

16S rRNA基因擴(kuò)增顯示3種細(xì)菌都出現(xiàn)了1500 bp左右的目標(biāo)條帶，無雜帶，特異性較好。1號細(xì)菌亮度最大，其次是3號細(xì)菌，2號細(xì)菌亮度較淡，見圖4。

序列比對結(jié)果顯示1號細(xì)菌為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，2號細(xì)菌為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)，3號細(xì)菌為唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)。

圖4 3種細(xì)菌產(chǎn)物凝膠電泳圖

3 討 論

本實驗成功建立了菌斑模型，見圖1。從中分離到糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)和唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)。大量的研究顯示這3種細(xì)菌同時存在于人類口腔中[10]。這3種細(xì)菌都屬于厚壁菌門(Firmicutes)、芽胞桿菌綱(Bacillales)、乳桿菌目(Lactobacillales)。糞腸球菌屬于腸球菌科(Enterococcaceae)、腸球菌屬(Enterococcus)，在難治性根尖周炎中，糞腸球菌的檢出率高達(dá)77%[11]，一般以單一感染為主[12]。本實驗中，大鼠的牙菌斑中檢測出糞腸球菌為主要優(yōu)勢菌之一。大多數(shù)根尖周炎繼發(fā)于牙髓疾病，而牙髓疾病是由于齲病、外傷等波及牙本質(zhì)深層，刺激通過牙本質(zhì)小管傳入牙髓，引起牙髓組織炎癥或修復(fù)反應(yīng)[13]。究其源頭有一部分是由于齲病引起難治性根尖周炎，而上世紀(jì)50年代Orland和Fifzgerald 等就認(rèn)識到，齲病無菌斑不成立[14]，菌斑中的糞腸球菌會通過牙本質(zhì)小管進(jìn)入牙髓，繼而到達(dá)根尖孔，接觸到血管、淋巴組織等。這種途徑進(jìn)入的糞腸球菌甚至?xí)鹁Y，隨著血液組織到達(dá)臟器，從而引起或加速臟器的病變。發(fā)酵乳桿菌屬于乳桿菌科(Lactobacillaceae)、乳桿菌屬(Lactobacillus)，發(fā)酵乳桿菌是口腔內(nèi)的正常菌群，該菌可以發(fā)酵多種糖，具有較強的產(chǎn)酸耐酸能力，在齲洞與牙菌斑中常見，只是數(shù)量少，黏附能力較弱。發(fā)酵乳桿菌是否能致齲存在著不同的看法，它在齲損的產(chǎn)生中不如在齲損的發(fā)展中起到的作用大，在齲損的發(fā)展中它本身的數(shù)量會增加，并且可以促進(jìn)損壞速度以及病變區(qū)其他致齲菌的黏附能力。唾液鏈球菌屬于鏈球菌科(Streptocpccaceae)、鏈球菌屬(Streptocpccus)。唾液鏈球菌在健康人體口腔中占重要地位，它可利用蔗糖合成水溶性果聚糖從而致齲。曾有實驗證實此菌種可對動物致齲，對人類卻無致齲性[15]。唾液鏈球菌對人體而言是一種益生菌，可以抑制多種微生物的活性，減少有害菌群在口腔和呼吸道的定植。唾液鏈球菌對口臭、口腔念珠菌病、中耳炎等的預(yù)防和治療有良好的效果。雖然Wistar大鼠與人類口腔組成相似，但也有研究表明，Wistar大鼠與人類口腔菌群結(jié)構(gòu)門水平、屬水平各不相同，在菌群豐富度與相似程度上也不相同[16]。本實驗在Wistar大鼠的喂養(yǎng)食物與時間、性別、菌斑獲取牙位等方面與上述研究可能不同，使得實驗結(jié)果不一致。

綜上所述，本次實驗在Wistar大鼠建立了菌斑模型，分離出了3種細(xì)菌，且Wistar大鼠產(chǎn)生齲病，提示它們可能對齲病的發(fā)生發(fā)展起到一定程度的作用，在人體中，可能也會有相似的作用。這可以為建立實驗動物菌斑模型、齲病模型，研究齲病防治方法等提供基礎(chǔ)性資料。Wistar大鼠的口腔牙菌斑微生物組成與人類相似，提示該模型動物可以為口腔微生物和口腔疾病的研究提供參考。