李宛宣，王世敏，趙 雁

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院, 云南 昆明 650201； 2. 昭通學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,云南 昭通 657000)

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)廣泛存在于細(xì)菌、真菌和動(dòng)植物細(xì)胞中，是葉綠素、維生素和亞鐵紅素等所有四氫吡咯化合物的合成前體[1-2]。ALA也是一種潛在的植物生長調(diào)節(jié)劑，能增加植物葉綠素的相對(duì)含量，提高植物光合作用，調(diào)控植物生長和產(chǎn)量，如月季(Rosahybrida)[3]、彩色馬蹄蓮(Zantedeschiahybrida)[4]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)[5]和水稻(Oryzasativa)[6]。給植物噴施ALA溶液有利于提高植物對(duì)多種非生物脅迫的抗性[7]，ALA可以提高葉片中的抗氧化酶(過氧化物酶(Peroxidase,POD)；抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)等)活性，提高植株清除活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的能力，降低丙二醛(Malonydialdehyde,MDA)含量和相對(duì)電導(dǎo)率，控制膜脂過氧化物的產(chǎn)生和大量電解質(zhì)的外滲，穩(wěn)定生物膜的完整性，增強(qiáng)葡萄(Vitisvinifera)的抗鹽性[8]和玉米(Zeamays)的抗冷性[9]。此外，ALA還能通過保護(hù)光系統(tǒng)II、提高光合運(yùn)轉(zhuǎn)速率，增強(qiáng)小麥(Triticumaestivum)[10]和草地早熟禾(Poapratensis)的抗旱性[11]；能通過上調(diào)關(guān)鍵基因表達(dá)量，增強(qiáng)黃瓜(Cucumissativus)的抗熱性[12]和油菜(Brassicanapus)的抗鹽性[13]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的豆科牧草，具有地面覆蓋率(10%～100%)大、根系深而發(fā)達(dá)、固氮能力強(qiáng)的特點(diǎn)，也是改善生態(tài)環(huán)境的優(yōu)良草種[14-16]，但高溫是限制其在熱帶和亞熱帶地區(qū)應(yīng)用的非生物脅迫之一[17]。高溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)紫花苜蓿細(xì)胞產(chǎn)生高濃度的ROS，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)的相對(duì)完整性，導(dǎo)致MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率上升，因此MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率常作為衡量高溫脅迫下植物受害程度的指標(biāo)[18-19]。此外，高溫脅迫還會(huì)降低紫花苜蓿的光合作用和呼吸效率，造成植物葉片萎焉、生長緩慢和病蟲害增多，影響其產(chǎn)量和品質(zhì)[20-22]。植物為了適應(yīng)環(huán)境，通過應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)誘導(dǎo)抗氧化酶活性來提高植物抗性[23]。過氧化物酶(Peroxidase,POD)是植物清除ROS的抗氧化酶之一，為典型的熱敏感酶和誘導(dǎo)酶，其活性變化間接反映紫花苜蓿耐熱性的強(qiáng)弱[24-25]。目前，ALA緩解紫花苜蓿高溫脅迫傷害的研究未見報(bào)道。本研究以云南地方品種‘德欽’紫花苜蓿(M.sativaL. ‘Deqin’)為材料，探究在高溫脅迫下噴施不同濃度ALA對(duì)其生長發(fā)育和生理生化的影響，以期為提高紫花苜蓿耐熱性和生產(chǎn)力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為‘德欽’紫花苜蓿，由畢玉芬教授提供。將當(dāng)年采收的種子播于花盆中(基質(zhì)為蛭石50%+珍珠巖50%)，放置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度為23℃/20℃(白/夜)，光周期為16 h/8 h(白/夜)，相對(duì)濕度為65%，光強(qiáng)為400 μmol·m-2·s-1，每隔2 d澆霍格蘭營養(yǎng)液200 mL。8周后紫花苜蓿處于營養(yǎng)生長期，留下健康、生長一致的小苗進(jìn)行藥劑噴施和高溫脅迫。

1.2 高溫脅迫方法

藥劑ALA來源于蘇州納美特生物科技有限公司，由吳紅芝教授提供。將4個(gè)不同濃度的[0 mg·L-1(清水對(duì)照，CK)，10 mg·L-1，30 mg·L-1，50 mg·L-1]ALA溶液噴施于紫花苜蓿葉面，噴施藥劑的時(shí)間參照梁金鳳[26]的方法并稍加修改，噴施1.5 h后置于人工氣候箱中進(jìn)行空氣高溫脅迫，脅迫48 h后迅速噴施相同濃度的ALA溶液，再次脅迫48 h后測定紫花苜蓿的生理和形態(tài)指標(biāo)。脅迫溫度為35℃/25℃(白/夜)，光周期為16 h/8 h (白/夜)，相對(duì)濕度為65%，光強(qiáng)為400 μmol·m-2·s-1，每隔2 d澆霍格蘭營養(yǎng)液200 mL。每個(gè)濃度處理5盆，每盆1棵苗，用3盆測定形態(tài)指標(biāo)，用2盆測定生理指標(biāo)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1形態(tài)指標(biāo)測定 參照梁金鳳[26]的方法并稍加修改，測定12棵紫花苜蓿在高溫脅迫前，每棵苗的葉片數(shù)、分枝數(shù)和生物量，并進(jìn)行掛牌標(biāo)記。高溫脅迫后，測定每個(gè)濃度處理后3棵苗的3個(gè)指標(biāo)，計(jì)算平均每棵苗的葉片增長率、分枝增長率和生物量增長率。

葉片增長率=(脅迫后的葉片數(shù)-脅迫前的葉片數(shù))/脅迫前的葉片數(shù)×100%

分枝增長率=(脅迫后的分枝數(shù)-脅迫前的分枝數(shù))/脅迫前的分枝數(shù)×100%

生物量增長率=(脅迫后的生物量-脅迫前的生物量)/脅迫前的生物量×100%

1.3.2相對(duì)電導(dǎo)率測定 參照葉尚紅[27]的方法稍加改良，稱取0.2 g葉位相同并完全展開的新鮮葉片，避開主脈剪成大小一致的葉塊放入試管中，加入15 mL蒸餾水，在室溫下放置30 min，測定電導(dǎo)率S1。置沸水浴中20 min，冷卻后測定電導(dǎo)率S2，并測定蒸餾水電導(dǎo)率S0，按下列公式計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率。

相對(duì)電導(dǎo)率(%)=(S1-S0)/(S2-S0)×100%

1.3.3葉綠體色素含量測定 葉綠體色素包含總?cè)~綠素(葉綠素a、葉綠素b)和類胡蘿卜素，測定參照葉尚紅[27]的方法并稍加改良。稱取0.1 g葉位相同并完全展開的新鮮葉片，用25 mL 80%的丙酮放黑暗條件下浸泡24 h，用分光光度計(jì)測定波長663 nm，646 nm和470 nm的光吸收值，并按下列公式分別計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量。

Ca(葉綠素a濃度)=12.21A663-2.81A646;

Cb(葉綠素b濃度)=20.13A646-5.03A663;

Cx(類胡蘿卜素)=(1000A470-3.27Ca-104Cb)/229;

C(葉綠素總濃度)=Ca+Cb;

葉綠體色素含量(mg·g-1)=[C(mg·L-1)×提取液總量(ml)]/[葉樣重量(g)×1 000]

其中A470，A646和A663分別代表待測液在470 nm，646 nm和663 nm波長下的吸光度值。

1.3.4MDA含量測定 參照葉尚紅[27]的方法稍加改良，稱取0.3 g葉位相同并完全展開的新鮮葉片，加入2 mL蒸餾水和少量石英砂研磨至勻漿，轉(zhuǎn)移到20 mL刻度試管中，再用3 mL蒸餾水分兩次沖洗研缽合并提取液。另取一支刻度試管，加入5 mL蒸餾水作空白對(duì)照。在提取液和空白對(duì)照中各加入0.5%硫代巴比妥酸溶液5 mL，在沸水浴上反應(yīng)15 min，取出試管冷卻后記下液體體積。轉(zhuǎn)入離心管中，3 000 rpm離心10 min，取上清液至1 cm比色皿中，測定在450 nm，532 nm和600 nm波長下的光吸收值，并按下列公式計(jì)算MDA含量。

提取液中MDA濃度(μmol·L-1)=(A532-A600) / (0.155×L)-0.56×A450

鮮組織中MDA含量(nmol·g-1)=提取液中MDA濃度×V(mL)/W(g)

其中A450，A532和A600分別代表待測液在450 nm，532 nm和600 nm波長下的吸光度值，V為提取液總體積(mL)，W為樣品重量(g)，L為比色皿厚度(cm)。

1.3.5POD活性測定 參照李合生[28]的方法稍加改良，稱取0.2 g葉位相同并完全展開的新鮮葉片，在冰浴上預(yù)冷的研缽中加入2 mL預(yù)冷磷酸緩沖液(0.05 mol·L-1，pH5.5)混合研磨成勻漿。4℃ 3 000 rpm離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，沉淀用磷酸緩沖液反復(fù)提取兩次，并轉(zhuǎn)入容量瓶，最后定容至—80℃低溫保存。POD酶反應(yīng)體系為：2.9 mL 0.05 mol·L-1磷酸緩沖液、1 mL 2% H2O2、1 mL 0.05 mol·L-1的愈創(chuàng)木酚和0.1 mL酶液。用煮沸10 min酶液作對(duì)照，反應(yīng)體系加入酶液后，立即在35℃的水浴中保溫3 min，然后用分光光度計(jì)測定波長470 nm的光吸收值A(chǔ)470，每隔1 min記錄1次吸光度，共記錄9次，然后以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)酶活性單位[μ·(g·min)-1]，并按下列公式計(jì)算POD活性。

POD活性=△A470×VT/(W×VS×0.01×t)

其中：△A470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化值，W為樣品鮮重(g)，t為反應(yīng)時(shí)間(min)，VT為提取酶液總體積(mL)，VS為測定時(shí)取用酶液體積(mL)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALA對(duì)紫花苜蓿MDA含量的影響

由圖1可知，對(duì)照(CK)與噴施不同濃度的ALA溶液相比，紫花苜蓿的MDA含量最高，差異不顯著。隨著ALA濃度的增加，MDA含量持續(xù)降低，但差異不顯著。在ALA濃度為50 mg·L-1時(shí)，紫花苜蓿MDA含量最低。

圖1 不同濃度ALA對(duì)紫花苜蓿MAD含量的影響

2.2 ALA對(duì)紫花苜蓿相對(duì)電導(dǎo)率的影響

由圖2可知，CK與噴施不同濃度的ALA溶液相比，紫花苜蓿的相對(duì)電導(dǎo)率最高，差異顯著(P<0.05)。隨著ALA濃度的增加，相對(duì)電導(dǎo)率先降低后升高，但差異不顯著。在ALA濃度為30 mg·L-1時(shí)，紫花苜蓿的相對(duì)電導(dǎo)率最低。

2.3 ALA對(duì)紫花苜蓿POD活性的影響

由圖3可知，CK與噴施不同濃度的ALA溶液相比，紫花苜蓿的POD活性最低。隨著ALA濃度的增加，POD活性持續(xù)降低，但差異不顯著。在ALA濃度為10 mg·L-1時(shí)，紫花苜蓿的POD活性最高，與對(duì)照相比，差異顯著(P<0.05)。

圖2 不同濃度ALA對(duì)紫花苜蓿相對(duì)電導(dǎo)率的影響

圖3 不同濃度ALA對(duì)紫花苜蓿POD活性的影響

2.4 ALA對(duì)紫花苜蓿形態(tài)特征的影響

由表1可知，噴施不同濃度的ALA溶液能影響高溫脅迫后的紫花苜蓿分枝數(shù)、葉片數(shù)和生物量。在ALA濃度為0 mg·L-1(CK)時(shí)，分枝數(shù)、葉片數(shù)和生物量的增長率都呈負(fù)增長。噴施ALA溶液的處理與CK相比，分枝數(shù)和葉片數(shù)的增長率不顯著，但噴施藥劑的增長效果比不噴施的效果好。在ALA濃度為10 mg·L-1時(shí)，葉片數(shù)增長率最高達(dá)12%，分枝數(shù)和生物量的增長率呈負(fù)增長；與CK相比，3個(gè)指標(biāo)差異不顯著，分枝數(shù)增長率有所增加，生物量增長率有所降低。在ALA濃度為30 mg·L-1時(shí)，生物量增長率最高達(dá)16%，差異顯著(P<0.05)，且葉片數(shù)增長率呈正增長，分枝數(shù)增長率與CK相比有所增加。在ALA濃度為50 mg·L-1時(shí)，分枝數(shù)增長率最高達(dá)31%，葉片數(shù)和生物量呈負(fù)增長。

2.5 ALA對(duì)紫花苜蓿葉綠體色素含量的影響

由圖4可知，噴施不同濃度的ALA溶液能影響高溫脅迫后紫花苜蓿葉綠體色素的含量。隨著ALA濃度的增加，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量先增高后降低。在ALA濃度為30 mg·L-1時(shí)，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量最高，與CK相比，差異不顯著。在ALA濃度為10 mg·L-1時(shí)，葉綠素a、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量最低，與ALA濃度為30 mg·L-1時(shí)相比，差異顯著(P<0.05)。

表1 不同濃度ALA對(duì)紫花苜蓿形態(tài)指標(biāo)的影響

注:不同小寫字母表示縱向差異顯著(P<0.05)

Note:Different lowercase letters indicate significant longitudinal difference at the 0.05 level

2.6 高溫條件下紫花苜蓿各形態(tài)指標(biāo)和生理指標(biāo)的相關(guān)分析

由表2可知，高溫脅迫下紫花苜蓿的分枝數(shù)增長率、葉片數(shù)增長率、生物量增長率、相對(duì)電導(dǎo)率、類胡蘿卜素含量、MDA含量和POD活性兩兩指標(biāo)之間的相關(guān)性不顯著。葉綠素a與葉綠素b (r=1.00，P<0.01)、總?cè)~綠素(r= 1.00，P<0.01)和類胡蘿卜素(r= 0.96，P<0.05)含量呈正相關(guān)，與MDA含量、POD活性相關(guān)性不顯著。葉綠素b與總?cè)~綠素(r= 1.00，P<0.01)、類胡蘿卜素(r=1.00，P<0.05)含量呈正相關(guān)，與MDA含量、POD活性相關(guān)性不顯著?？?cè)~綠素與類胡蘿卜素(r= 1.00，P<0.05)含量呈正相關(guān)，與MDA含量、POD活性相關(guān)性不顯著。

相關(guān)系數(shù)Thecorrelationcoefficient分枝數(shù)增長率Growthrateofbranchnumber葉片數(shù)增長率Bladegrowthrate生物量增長率Biomassgrowthrate相對(duì)電導(dǎo)率Relativeconductivity葉綠素a含量Chlorophyllacontents葉綠素b含量Chlorophyllbcontents總?cè)~綠素含量Totalchlorophyllcontents類胡蘿卜素含量CarotenoidcontentsMDA含量MDAcontentsPOD活性PODactivity分枝數(shù)增長率Growthrateofbranchnumber1.00葉片數(shù)增長率Bladegrowthrate0.271.00生物量增長率Biomassgrowthrate-0.690.511.00相對(duì)電導(dǎo)率Relativeconductivity-0.03-0.77-0.521.00葉綠素a含量Chlorophyllacontents-0.870.020.820.071.00葉綠素b含量Chlorophyllbcontents-0.89-0.040.790.101.00**1.00總?cè)~綠素含量Totalchlorophyllcontents-0.870.010.810.071.00**1.00**1.00類胡蘿卜素含量Carotenoidcontents-0.79-0.120.650.320.96*1.00*1.00*1.00MDA含量MDAcontents0.25-0.11-0.250.720.130.120.130.361.00POD活性PODactivity0.680.71-0.10-0.75-0.65-0.69-0.65-0.78-0.391.00

注：*表示相關(guān)性顯著(P<0.05)，**表示相關(guān)性極顯著(P<0.01)

Note:* indicates significant correlation at the 0.05 level,and ** indicates extremely significant correlation at the 0.01 level

3 討論

3.1 噴施ALA提高紫花苜蓿的抗熱性

當(dāng)植物受到高溫脅迫時(shí)，大量的ROS會(huì)加深細(xì)胞膜脂過氧化損傷和破壞細(xì)胞膜的相對(duì)完整性，進(jìn)一步引起各項(xiàng)代謝活動(dòng)內(nèi)環(huán)境遭受破壞[25]。MDA是細(xì)胞膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其含量的高低間接反應(yīng)植物受傷害的程度[29]。此外，細(xì)胞膜的相對(duì)完整性被破壞，大量電解質(zhì)外滲，進(jìn)而導(dǎo)致膜功能紊亂和植株傷害[30]。MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率常用于衡量植物遭受高溫傷害程度的指標(biāo)[31]，如肇東苜蓿(M.sativaL. cv. Zhaodong)[29]、不結(jié)球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)[32]、菜豆(Phaseolusvulgaris)[33]、大豆(Glycinemax)[34]等。在抗逆性研究中，ALA在提高植物的抗逆性方向中具有廣闊的應(yīng)用前景[35]。ALA是具有多種生物活性的非蛋白氨基酸，可作為植物的一種外源生長調(diào)節(jié)劑，對(duì)緩解植物抗熱脅迫具有重要作用[36-37]。在本試驗(yàn)中，噴施不同濃度的ALA溶液與CK相比，MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率都低，說明高溫破壞了紫花苜蓿細(xì)胞膜系統(tǒng)，噴施ALA有利于降低細(xì)胞膜脂過氧化程度和細(xì)胞膜通透性，提高細(xì)胞膜的相對(duì)穩(wěn)定性。隨著ALA濃度的增加，MDA含量逐漸降低，相對(duì)電導(dǎo)率先降低后升高，這可能與高濃度的ALA溶液能增加紫花苜蓿細(xì)胞電解質(zhì)的流動(dòng)性有關(guān)。

3.2 ALA調(diào)控紫花苜蓿在高溫脅迫下的生長

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以‘德欽’紫花苜蓿為材料，觀察高溫脅迫下噴施不同濃度的ALA對(duì)紫花苜蓿形態(tài)和生理指標(biāo)的影響。在葉面噴施30 mg·L-1濃度的ALA溶液時(shí)，有利于提高紫花苜蓿葉片中POD活性、降低細(xì)胞膜過氧化程度和細(xì)胞膜通透性，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞葉綠體色素和增加其干物質(zhì)的積累，促進(jìn)植株的生長發(fā)育。