聶秀美，趙桂琴，孫浩洋，柴繼寬，吳文斌，林 龍, 孫雷雷，王 軍，王苗苗，康曉強

(甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

燕麥(Avenasativa)是禾本科燕麥屬一年生世界性栽培作物[1]，具有廣泛的生態(tài)適應(yīng)性、豐富的營養(yǎng)價值和獨特的保健功能[2-3]，在我國主要分布于西南、華北、西北等高寒冷涼地區(qū)[4]，對我國畜牧業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、生態(tài)環(huán)境改善等方面具有重要意義[5-6]。

燕麥葉斑病(Drechsleraavenacea)又稱條紋葉枯病，主要為害燕麥葉片和葉鞘，發(fā)病初期病斑呈灰綠色水漬狀，隨著病情加重，漸變?yōu)闇\褐色至紅褐色橢圓形病斑。在低溫高濕環(huán)境中，病斑還可擴展成不規(guī)則形條斑甚至融合成片，導致葉片枯死脫落，嚴重影響燕麥的生產(chǎn)性能和飼用價值[7]。其病原菌多以分生孢子或菌絲在田間病殘體上越冬，第2年回春時產(chǎn)生的病原物可從幼嫩組織侵入燕麥植株體，發(fā)病后的燕麥植株所攜帶的致病菌菌絲或分生孢子又可反復進行多次侵染[8]。該病害在燕麥重病田的發(fā)病率高達90%以上，在美國、加拿大、波蘭等國家都是燕麥生產(chǎn)中的主要病害，在巴西被認為是流行最快的病害，可危害燕麥的幼苗、葉片及種子，一般減產(chǎn)5%～10%，重者可達30%以上[9-11]。

燕麥葉斑病盡管在很多國家都有發(fā)生，但都鮮見報道，我國對這種病害的研究報道更少，僅見袁軍海等[12]于2013對河北省張家口市的51個燕麥品種進行葉斑病抗性鑒定，其結(jié)果表明不同品種間的抗病性差異較大，病葉率為70.83%～100%，病情指數(shù)為20.31～84.87，僅4個燕麥品種表現(xiàn)為中度抗病。東保柱[13]在內(nèi)蒙古武川縣和河北壩上對兩地共有的39個主栽燕麥品種進行研究表明，不同品種對葉斑病的抗性不同，同一品種在不同地區(qū)的抗性表現(xiàn)也存在差異，如‘白燕2號’在河北表現(xiàn)為免疫，在內(nèi)蒙古表現(xiàn)為髙抗；‘壩燕4號’、‘壩莜8號’、‘埂莜5號’在河北表現(xiàn)為中感，在內(nèi)蒙古表現(xiàn)為高感。劉萬友[14]對不同栽培條件下燕麥葉斑病的發(fā)病情況進行研究表明，播期是影響該病害的最主要因素，通過利用不同殺菌劑進行試驗表明40%的多菌靈對該病害具有較好的防治效果，且拌種處理較葉面噴施效果更好。張笑宇等[15]采用組織分離法從內(nèi)蒙古自治區(qū)武川縣和河北省張家口市張北縣采集的燕麥葉斑病病葉中共分離培養(yǎng)出3株菌株，鑒定表明這3株病原菌均為燕麥內(nèi)臍蠕孢菌(Drechsleraavenae)，其有性態(tài)為燕麥核腔菌(Pyrenophoraavenae)。天祝藏族自治縣地區(qū)是甘肅省的主要畜牧業(yè)基地之一，具有典型的農(nóng)牧交錯區(qū)特點。燕麥是該區(qū)域主要的栽培牧草，也是當?shù)丶倚罄浼狙a飼的主要飼草來源。但近年來，該地區(qū)燕麥葉斑病逐年加重，嚴重影響當?shù)匮帑湲a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，本研究擬通過對天祝縣燕麥葉斑病的發(fā)生情況進行調(diào)查，對采集到的病葉進行病原菌的分離和鑒定，以明確葉斑病在天?？h的發(fā)生情況，確定病原菌種類，為當?shù)匮帑溔~斑病病害的進一步研究和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查

于2018年7月對甘肅省天?？h松山鎮(zhèn)黑馬圈河村(103°40′ E，37°17′ N，海拔2 885 m)、東大灘鄉(xiāng)上泉村(103°42′ E，37°20′ N，海拔2 699 m)和酸茨溝村(103°30′ E，37°25′ N，海拔2 653 m)、安遠鎮(zhèn)柳樹村(102°85′ E，37°25′ N，海拔2 708 m)、抓喜秀龍鄉(xiāng)南泥溝村(102°79′ E，37°21′ N，海拔2 866 m)種植的甜燕麥品種進行了田間葉斑病發(fā)生情況的調(diào)查。每個點隨機選取3塊樣地，避開地邊5 m，采用“Z”字型5點取樣法，每點調(diào)查燕麥植株的上部、中部、下部共計50片葉，逐片記錄發(fā)病情況，并進行病葉率和病情指數(shù)的計算。葉斑病的病葉率、病情指數(shù)的計算和評價標準參照袁軍海等[12]的計算方法和評價標準，病級劃分標準見表1。

病葉率(%)=病葉數(shù)/調(diào)查葉片總數(shù)×100

式中：S為病情指數(shù)；i為病級數(shù)(1～n)；Xi為病情為i級的單元數(shù)；Si為病情為i級的嚴重度值。

表1 燕麥葉斑病病級劃分標準

1.2 病原菌鑒定

1.2.1病原菌的分離培養(yǎng) 將采集的燕麥病葉標本帶回實驗室后，參照Xue等[16]和李戌清等[17]的方法在病健交界處選取具有典型葉斑病癥狀的組織，經(jīng)自來水沖洗，用70%酒精表面消毒1 min，5%次氯酸鈉消毒5 min，無菌水沖洗3～5次后用滅菌濾紙吸干表面水分，再剪成5 mm的小塊，隨機選擇5塊均勻放在直徑90 mm的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)平板上，5皿為1重復，4次重復，置25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待長出菌絲后及時進行單菌分離和純化，純化后的菌株用20%的甘油于—20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2病原菌的致病性鑒定

離體葉片接種 張莉等[18]和張笑宇等[15]的方法進行病原菌的致病性鑒定。選取健康、無病斑的燕麥葉片，自來水沖洗干凈，剪取葉片中間5 cm長的葉段，用70%酒精消毒1 min，5%次氯酸鈉消毒5 min，無菌水沖洗3～5次后用滅菌濾紙吸干葉片表面的水分。用無菌打孔器在培養(yǎng)7 d的菌株上取直徑5 mm的待測菌株塊接種于燕麥葉片表面，每皿放4片葉段，每處理重復4次，以接種相同大小的新鮮PDA培養(yǎng)基塊為對照。于25℃恒溫培養(yǎng)，及時觀察發(fā)病情況，第4 d對發(fā)病燕麥葉片組織進行病原菌的再分離，檢驗接種前后病原菌是否一致。

活體葉片接種 每盆留苗10株。當燕麥長至3～4葉期時，選取大小一致的3株幼苗，用無菌打孔器在培養(yǎng)7 d的菌株上取直徑5 mm的待測菌株塊，接種在燕麥葉片第3葉中間，用紗布和保鮮膜固定菌餅，每處理重復4次，以接種相同大小的新鮮PDA培養(yǎng)基塊為對照。接種后的燕麥葉片用塑料袋罩住置于25℃，黑暗14 h、濕度95%，光照10 h、濕度75%的恒溫保濕培養(yǎng)箱黑暗光照交替培養(yǎng)48 h后取下塑料袋繼續(xù)培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。第7 d時對病斑進行病原菌的再分離，檢驗接種前后病原菌的一致性。

1.2.3病原菌的形態(tài)學鑒定 將純化后的病原菌接種在新鮮PDA平板上于25℃黑暗培養(yǎng)7 d后，觀察菌落和分生孢子的形狀、顏色和大小等形態(tài)學特征進行初步鑒定。

1.2.4病原菌的分子生物學鑒定 采用真菌基因組Omega試劑盒提取菌株DNA，以真菌特異性引物對ITS1和ITS4進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個循環(huán)后在72℃下再延伸7 min。取PCR擴增產(chǎn)物5 μL,用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測后送樣進行測序，所得序列經(jīng)Clustal W軟件進行堿基校對后，與GenBank中已知序列進行相似性比對，用Mega 7.0軟件經(jīng)Bootstrap 1000次循環(huán)檢驗后以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉斑病的發(fā)生情況

通過對天?？h葉斑病發(fā)生情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，各燕麥種植區(qū)域的葉斑病發(fā)病情況存在明顯差異(表2)，發(fā)病率為64.20%～99.58%，病情指數(shù)介于23.00～61.81之間。松山鎮(zhèn)黑馬圈河村和東大灘鄉(xiāng)上泉村的發(fā)病情況最嚴重，前者的葉斑病病葉率高達92.78%，病情指數(shù)為61.81；后者的病葉率最高，為99.58%，病情指數(shù)也較高，為60.02。柳樹村、南泥溝村、酸茨溝村的發(fā)病也較重，其中柳樹村和酸茨溝村的發(fā)病程度接近，病葉率均為64.51%，病情指數(shù)為25.47。南泥溝村的病葉率和病情指數(shù)相對較低，分別為64.20%和23.00。

表2 天?？h地區(qū)燕麥葉斑病的發(fā)生情況

2.2 病原菌的致病性測定

對從燕麥葉斑病病葉上分離獲得的菌株通過離體葉片和活體葉片致病性接種試驗發(fā)現(xiàn)，有6株菌株對燕麥葉片具有致病性，將其依次編號為AS-L-1～AS-L-6。圖1為病原菌的致病性表現(xiàn)。離體葉片接種2 d時(圖1 A～D)，菌餅周圍布滿菌絲，葉片接種部位開始出現(xiàn)輕微的褪綠癥狀，部分接種菌餅的葉片表面逐漸浮現(xiàn)出輕微的病斑，對照無任何變化；接種4 d時(圖1 E～H)，菌餅面積明顯擴大，葉片出現(xiàn)大面積褪綠現(xiàn)象，接種部位有明顯的病斑，葉片表面也開始出現(xiàn)病斑，而對照不發(fā)病?；铙w葉片接種3 d時，接種部位開始顯癥，有輕微的褪綠現(xiàn)象，葉片表面開始出現(xiàn)菌絲，而接種PDA培養(yǎng)基的對照葉片未發(fā)?。唤臃N5 d時，接種部位褪綠現(xiàn)象加重，并出現(xiàn)淺褐色或褐色小斑點；接種7 d時(圖1 I)，病斑面積明顯擴大，病斑呈褐色或黃褐色，對照未發(fā)病。將發(fā)病燕麥離體葉片和活體葉片進行病斑再分離，發(fā)現(xiàn)所得病原菌與接種病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征相同，符合致病菌的柯赫氏法則驗證，說明這6株菌株均為燕麥葉斑病的致病菌。

圖1 燕麥離體葉片和活體葉片的接種癥狀

2.3 病原菌的形態(tài)特征

對分離到的燕麥葉斑病病原菌在PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)7 d后，進行形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)其菌落培養(yǎng)特征和孢子形態(tài)特征明顯不同，部分病原菌的菌落和孢子形態(tài)如圖2所示。

細交鏈孢(圖2 A～C)菌落生長速度較快，稍隆起，近似圓形，直徑約62 mm，表面粗絨狀，呈灰褐色，有同心圓，邊緣整齊，為白色，氣生菌絲濃密。背面黑褐色，邊緣褐色。分生孢子單生或串生，倒棍棒狀，倒梨形或橢圓形，淡黃褐色至褐色，大小為(9.10～24.20)μm×(3.40～8.50)μm，具縱橫隔膜，橫隔1～6個，縱隔0～3個。

芽枝狀枝孢菌(圖2 D～F)的菌落生長速度較慢，平鋪，圓形，直徑約30 mm，表面粉狀，邊緣整齊，氣生菌絲稀疏，有放射狀紋理，整體呈深綠色，背面黑綠色。分生孢子橢圓形，橄欖色，大小為(4.30～8.50)μm×(2.20～4.80)μm，無隔膜。

黑附球菌(圖2 G～I)的菌落生長速度緩慢，均勻隆起，近似圓形，直徑約25 mm，表面絨狀，呈米黃色，氣生菌絲濃密，背面焦糖色。分生孢子單生，球形，黃褐色至褐色，大小為1.10 μm×2.50 μm，無隔膜。

燕麥內(nèi)臍蠕孢(圖2 J～L)的菌落生長速度較快，平鋪，近似圓形，直徑約68 mm，表面粗絨狀，中央淺棕色至棕色，邊緣乳白色，氣生菌絲稀疏，背面中央黑褐色。分生孢子單生，圓柱狀，褐色，大小為(10.52～32.47)μm×(3.24～9.63)μm，具橫隔3～7個。

2.4 病原菌rDNA-ITS序列系統(tǒng)進化分析

采用真菌ITS區(qū)通用擴增引物對ITS1和ITS4對6株致病菌的DNA進行擴增測序，并通過GenBank數(shù)據(jù)庫對這6個菌株的堿基序列同已知物種序列進行同源性比對，結(jié)果表明，各比對樣品與數(shù)據(jù)庫中序列相似性均在98%以上。進一步采用Mega 7.0軟件用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行物種間序列比對分析(圖3)，結(jié)果表明菌株AS-L-1～AS-L-6的rDNA-ITS序列依次與細交鏈孢(Alternariaalternata(MF1011))、芽枝狀枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides(KY400091))、燕麥內(nèi)臍蠕孢(MK632061)、黑附球菌(Epicoccumnigrum(MK632017))、燕麥核腔菌(MK044614)和德氏霉菌(Pyrenophorachaetomioides(MH3992780)) 的親緣關(guān)系最近，單獨形成分支。結(jié)合形態(tài)特征，最終確定AS-L-1～AS-L-6這6個致病菌株分別為細交鏈孢、芽枝狀枝孢菌、燕麥內(nèi)臍蠕孢、黑附球菌、燕麥核腔菌和德氏霉菌。

通過對6個菌株的rDNA-ITS序列進行聚類分析(圖4)表明，6株菌株分屬于4個真菌屬，其中德氏霉屬(Drechslera)3株，分別為燕麥內(nèi)臍蠕孢、燕麥核腔菌和德氏霉菌；鏈格孢屬(Alternaria)、附球菌屬(Epicoccum)和枝孢屬(Cladosporium)各1株，分別為細交鏈孢、芽枝狀枝孢菌和黑附球菌。

圖3 6個病原菌株的rDNA-ITS序列同已知物種同源序列的系統(tǒng)進化分析

圖4 菌株AS-L-1～AS-L-6的rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 病原菌的分布情況

由表3可知，不同來源的供試材料攜帶的病原菌種類存在明顯差異，來自安源鎮(zhèn)柳樹村的材料攜帶的病原菌株最多，為6株；其次是松山鎮(zhèn)黑馬圈河村和抓喜秀龍鄉(xiāng)南泥溝村的材料，除未攜帶芽枝狀枝孢菌和黑附球菌外，其它4株病原菌均能在這2份材料中檢出；東大灘鄉(xiāng)上泉村和酸茨溝村材料中分離出的病原菌株相對較少，都僅有3株。另外，從各供試材料中均可分離出細交鏈孢和燕麥內(nèi)臍蠕孢，而芽枝狀枝孢菌僅在安源鎮(zhèn)柳樹村材料中分離到。燕麥核腔菌除從東大灘鄉(xiāng)上泉村材料中未檢出外，在其它材料中均可檢測到。

3 討論

作物在整個生長發(fā)育過程中，都會受到各種病害的危害，這些病害主要由病原菌侵染引起[19]。燕麥葉斑病是一種真菌性病害。整個生物界由病原真菌引發(fā)的真菌病害約占植物病害的70%～80%，這些真菌具有分布廣、種類多、發(fā)病快、隱蔽性強、危害重等特性，通常會侵入植物的質(zhì)外體或細胞獲取營養(yǎng)，形成寄生關(guān)系，從而使植物致病[20-21]。

病葉率和病情指數(shù)是反映植物病害發(fā)生情況或危害狀況的重要指標。本試驗通過對天?？h5個燕麥種植區(qū)的葉斑病發(fā)生情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其病葉率在64.20%～99.58%之間，病情指數(shù)變化范圍為23.00～61.81，其中黑馬圈河村和上泉村葉斑病發(fā)病最嚴重，其它3個調(diào)查區(qū)域的發(fā)病也較重，這與金柳艷等0對在不同環(huán)境下的5個相同玉米(Zeamay)品種的病害調(diào)查結(jié)果類似。植物與病原菌的相互作用是一個復雜的生物學過程，植物對病原菌的防御能力除受植物本身遺傳特性的影響外，還可能與其自身對不同地理環(huán)境的適應(yīng)性和管理措施有差異有關(guān)[23-24]。本研究通過對不同來源的供試病樣進行致病菌檢測后發(fā)現(xiàn)，在柳樹村材料中檢出的病原菌種類最多；黑馬圈河村和南泥溝村次之；上泉村材料中分離出的病原菌最少，這可能是因為葉斑病致病菌在低溫高濕環(huán)境中易發(fā)生侵染和傳播，而且其發(fā)生程度與播期、種植密度、施肥量、品種和灌水量等田間管理措施密切相關(guān)，但由于在不同地理環(huán)境條件下病害發(fā)生和流行的致病環(huán)境因子存在差異，因此不同調(diào)查區(qū)域的病害致病菌有所不同[25-26]。本研究是對天?？h不同燕麥種植區(qū)域同一燕麥品種的病害情況進行調(diào)查，可以說明造成其發(fā)病情況存在差異的主要因素是區(qū)域間的環(huán)境因子和管理措施。

表3 燕麥葉斑病病原菌的分布情況

注：“+”表示從供試材料中可分離到該菌，“-”表示從供試材料中未分離到該菌

Note:“+” indicates the fungus was isolated from the tested materials,“-” indicates the fungus was not isolated from the tested materials

采用柯赫氏法則、傳統(tǒng)形態(tài)學分類法和rDNA-ITS序列分析法可以準確鑒定致病真菌種類，克服傳統(tǒng)分類鑒定方法中致病菌株培養(yǎng)數(shù)量多、形態(tài)特征復雜和易受外界環(huán)境條件影響等因素，從而可以對病原菌進行快速準確的診斷和鑒定[27-28]。本研究通過對燕麥葉斑病病原菌分離物經(jīng)致病性鑒定、形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定，共發(fā)現(xiàn)5種不同種類的致病菌，這些菌株與其各自所對應(yīng)的GenBank庫中的序列同源性均在98%以上，具有很近的親緣關(guān)系。進一步對其進行聚類分析后發(fā)現(xiàn)，這些致病菌株分為4個真菌屬，其中德氏霉屬3株，鏈格孢屬、附球菌屬和枝孢屬各1株。目前，國內(nèi)僅對由燕麥內(nèi)臍蠕孢引起的燕麥葉斑病有所報道[15]，對本研究發(fā)現(xiàn)的細交鏈孢、芽枝狀枝孢菌和德氏霉菌引起的燕麥葉斑病還未見報道。但已有研究表明，這些病原菌可在高粱(Sorghumbicolor)[29]、芒果(Mangiferaindica)[30]和小麥(Triticumaestivum)[31]等植物上引起葉斑病。因此，本研究新發(fā)現(xiàn)的這些病原菌為國內(nèi)首次報道，關(guān)于這些病原菌在燕麥上的發(fā)生規(guī)律、致病機理及防治措施等還需進一步研究。

基于ITS基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹對于不同屬的真菌鑒別能力較強，在種水平上也有較好的鑒別力[32]。本研究也證實了這一點，能夠?qū)⒋龣z測菌株在屬和種水平上分開。細交鏈孢和黑附球菌的寄主范圍較廣泛，易造成嚴重危害，而且這些病原菌可以通過侵染田間雜草完成其生活史或者越冬，在適宜條件下，進行病原菌的再次傳播，成為葉斑病的侵染源[33-34]。因此，及早重視其潛在威脅，加強該病害致病機理方面的研究，篩選和使用高效低毒殺菌劑或生防菌劑，進行田間雜草防除是控制燕麥葉斑病的重要措施。另外，本研究在病原菌的分離過程中發(fā)現(xiàn)，病原菌以單獨侵染為主，但存在2～3種共同侵染燕麥葉片的現(xiàn)象。這與已有的研究結(jié)果類似[35-36]，這可能是因為致病菌對外界環(huán)境的適應(yīng)性具有相似性，能夠進行生長和繁殖，而且某些致病菌在產(chǎn)生病斑后對其他病菌的侵入有誘導作用，使復合侵染成為可能[37-38]。因此，還需對燕麥葉斑病致病菌的復合侵染規(guī)律進行明確，從而能夠制定更好的防控措施。

4 結(jié)論

天?？h燕麥種植區(qū)的葉斑病發(fā)生較嚴重。5個村鎮(zhèn)葉斑病的發(fā)病率為64.20%～99.58%，病情指數(shù)為23.00～61.81。其中松山鎮(zhèn)黑馬圈河村和東大灘鄉(xiāng)上泉村發(fā)病最嚴重，其病葉率在92%以上，病情指數(shù)60以上。引起天祝縣燕麥葉斑病的病原菌共有4屬5種，分別為燕麥內(nèi)臍蠕孢、細交鏈孢、芽枝狀枝孢菌、黑附球菌和德氏霉菌。