李 波，鄔婷婷，李 紅，楊 曌，林 浩

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾161005)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種多年生豆科牧草，世界上廣泛種植，具有產(chǎn)草量高、利用年限長、再生性強、適口性好、營養(yǎng)豐富等特點[1]，對改善土壤理化環(huán)境具有一定程度的作用。鹽堿土作為一種土壤類型分布廣泛，全世界的鹽堿土地面積約有9.54×109hm2，分布于各大洲干旱地區(qū)，主要集中于歐亞大陸、非洲、美洲西部，我國的鹽堿土地面積為9 913×104hm2，主要分布于東北、華北、西北內(nèi)陸地區(qū)以及長江以北沿海地帶，土地鹽堿化問題已經(jīng)成為影響世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最主要非生物脅迫之一，是影響區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展和生態(tài)恢復(fù)的重要因素[2]。不同濃度的鹽溶液對種子的萌發(fā)影響不同，同種鹽分對不同牧草的種子萌發(fā)的影響也不盡相同。一般低鹽濃度對苜蓿種子萌發(fā)均有促進(jìn)作用，隨鹽處理濃度增高，發(fā)芽率一般呈下降趨勢，不同濃度的鹽脅迫下苜蓿種子的適應(yīng)情況不同，同一苜蓿種子在萌發(fā)時對不同鹽的適應(yīng)情況也不同[3]。外源物質(zhì)改善植物受到非生物脅迫的手段在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中應(yīng)用廣泛，脫落酸(Abscisic acid，ABA)作為一種脅迫激素，能夠調(diào)節(jié)植物對脅迫環(huán)境的適應(yīng)，提升植物對鹽堿脅迫的耐受性，改善鹽堿地上植物的生長[4-5]。本試驗研究通過外施ABA，探討不同濃度ABA溶液浸種對蘇打鹽堿脅迫下苜蓿種子萌發(fā)特性的影響，為解決苜蓿種子萌發(fā)的鹽害問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以2種耐蘇打鹽堿性不同的紫花苜蓿品種的種子作為試驗材料，分別為WL343HQ和龍牧807苜蓿(MedicagosativaL.cv. Longmu No.807)品種種子，均由黑龍江省畜牧研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1混合蘇打鹽堿脅迫苜蓿種子的發(fā)芽實驗 挑選籽粒飽滿2種苜蓿品種的種子各100粒，整齊擺放在平鋪充分潤濕的濾紙的發(fā)芽盒中，每個品種各處理重復(fù)3次。按照NaHCO3∶Na2CO3=9∶1的比例配制蘇打鹽堿溶液(1 mmol·L-1蘇打鹽堿含0.9 mmol·L-1NaHCO3和0.1 mmol·L-1Na2CO3)，倒入平鋪有濾紙的發(fā)芽盒中，使濾紙充分潤濕(約20 mL)。蘇打鹽堿脅迫濃度分別為20，25，30，35，40，45，50，55和60 mmol·L-1，對兩種苜蓿種子進(jìn)行不同濃度蘇打鹽堿脅迫，對照組則使用蒸餾水。擺放完畢后稱重，記錄重量以便每天通過補水維持脅迫溶液的種子的濃度。每天觀察并記錄發(fā)芽種子的個數(shù)。發(fā)芽盒置于HPG-280BX光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃。7 d后隨機選取各處理組10株芽苗測量每個芽苗的胚芽長、胚根長及10株芽苗的總鮮重，測量后的芽苗置于濾紙上陰干5 d，在80 ℃烘干箱烘干至恒重，測量芽苗干重。經(jīng)7 d后分別選擇兩品種發(fā)芽率最接近50%的濃度組進(jìn)行下一步試驗。

1.2.2ABA處理苜蓿種子 配制不同濃度(25，50，75和100 μmol·L-1)的ABA溶液，對照組為蒸餾水，在避光條件下對2種苜蓿種子進(jìn)行6 h浸種。浸種結(jié)束后，用蒸餾水將浸種的種子洗滌2次，洗滌過后，WL343HQ苜蓿種子使用濃度為40 mmol·L-1的蘇打鹽堿溶液進(jìn)行脅迫，龍牧807苜蓿種子使用濃度為35 mmol·L-1的蘇打鹽堿溶液進(jìn)行脅迫，培養(yǎng)條件和測定指標(biāo)同1.2.1。

1.2.3測定指標(biāo) 各指標(biāo)測定公式[1]如下：

發(fā)芽率(%)= G7/N×100%；

發(fā)芽勢(%)=G3/N×100%；

發(fā)芽指數(shù)(%)(GI)=ΣG7/D7×100%；

活力指數(shù)=GI×S。

其中G3表示3 d內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，G7表示7 d內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt表示相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)，N為種子總數(shù)，S表示平均主根長度(mm)。

胚根長(mm)：每組發(fā)芽盒中10株長勢均勻的萌發(fā)芽苗胚根的平均值；

胚芽長(mm)：每組發(fā)芽盒中10株長勢均勻的萌發(fā)芽苗胚芽的平均值；

鮮重(mg)：每組發(fā)芽盒中10株長勢均勻的萌發(fā)芽苗的總重量；

干重(mg)：每組發(fā)芽盒中10株長勢均勻的萌發(fā)芽苗烘干后的總重量；其中根長、芽長和鮮重于試驗培養(yǎng)第7 d進(jìn)行測定。

1.2.4數(shù)據(jù)處理與分析 數(shù)據(jù)用SPSS19.0和Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分(ANOVA)和新復(fù)極差法(Duncan)比較同一品種的不同處理間的差異顯著性，P<0.05時有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化：

隸屬度的計算[6]：對測得數(shù)據(jù)進(jìn)行用模糊數(shù)學(xué)隸屬度公式進(jìn)行轉(zhuǎn)換，隸屬函數(shù)公式為：

U(Xijk)=(Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)

公式中，U(Xijk)、U′(Xijk) 為第i個品種第j個脅迫濃度的k項指標(biāo)的隸屬度，Xmin、Xmax分別為k項指標(biāo)的最小值和最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合蘇打鹽堿脅迫對苜蓿種子發(fā)芽率的影響

不同濃度(20～60 mmol·L-1)混合蘇打鹽堿對兩種苜蓿種子脅迫時發(fā)芽率變化見表1。在同一蘇打鹽堿脅迫濃度下，種子發(fā)芽率為WL343HQ>龍牧807。

兩種苜蓿品種種子發(fā)芽率均隨蘇打鹽堿濃度增加呈下降趨勢，種子發(fā)芽率均低于對照組。35 mmol·L-1以下低蘇打鹽堿濃度對WL343HQ種子萌發(fā)抑制作用較小，高于40 mmol·L-1蘇打鹽堿濃度嚴(yán)重影響WL343HQ種子萌發(fā)，發(fā)芽率均低于60%；而龍牧807種子在蘇打鹽堿脅迫濃度為55和60 mmol·L-1時，種子的發(fā)芽率為0，說明此濃度下完全抑制了龍牧807苜蓿種子的萌發(fā)。30 mmol·L-1以下低蘇打鹽堿濃度對其種子萌發(fā)的抑制作用較小，高于35 mmol·L-1蘇打鹽堿濃度嚴(yán)重影響龍牧807種子萌發(fā)，除龍牧807在20 mmol·L-1蘇打鹽堿脅迫濃度外，其它蘇打鹽堿濃度下兩品種種子的發(fā)芽率均與對照差異顯著(P<0.05)。

為確定兩種苜蓿種子耐蘇打鹽堿適宜濃度，以種子發(fā)芽率作為蘇打鹽堿脅迫適宜濃度指標(biāo)，對兩種苜蓿種子發(fā)芽率進(jìn)行線性回歸，回歸曲線和回歸方程見圖1，WL343HQ對蘇打鹽堿脅迫的半致死濃度為42.41 mmol·L-1，龍牧807的半致死濃度為36.61 mmol·L-1，確定WL343HQ和龍牧807后續(xù)試驗蘇打鹽堿濃度分別采用40 mmol·L-1和35 mmol·L-1。

圖1 蘇打鹽堿脅迫下2種苜蓿種子發(fā)芽率的變化

表1 蘇打鹽堿脅迫下苜蓿種子的發(fā)芽率

注：同列不同小寫字母表示脅迫濃度間在0.05水平差異顯著;“0” 代表在脅迫處理下種子未萌發(fā)，下同

Note:Different normal letters in line show significant different among stress concentration at the 0.05 level;“0” indicates no germinate of seedings under stress treatment,the same as below

2.2 ABA對受混合蘇打鹽堿脅迫苜蓿種子萌發(fā)的影響

2.2.1發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù) 經(jīng)不同濃度的ABA緩解處理的受蘇打鹽堿脅迫的WL343HQ和龍牧807苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均隨ABA濃度的增加呈先升后降趨勢，各指標(biāo)均在ABA濃度為75 μmol·L-1時達(dá)到最高值(表2，表3)。在相同ABA濃度下，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均為WL343HQ>龍牧807。

WL343HQ發(fā)芽率在ABA濃度為50～100 μmol·L-1時均高于對照(ABA濃度0 μmol·L-1，鹽堿濃度為40 mmol·L-1)，除25 μmol·L-1ABA濃度外，其它ABA處理組發(fā)芽率均與對照差異顯著(P<0.05)；龍牧807發(fā)芽率在ABA處理濃度為75和100 μmol·L-1時高于對照(ABA濃度0 μmol·L-1，鹽堿濃度為35 mmol·L-1)，除50和100 μmol·L-1ABA濃度外，其它ABA處理組發(fā)芽率均與對照差異顯著(P<0.05)。WL343HQ發(fā)芽勢在ABA濃度為25 μmol·L-1時低于對照，50～100 μmol·L-1時均高于對照，除50 μmol·L-1ABA濃度外，其它ABA處理組發(fā)芽勢均與對照差異顯著(P<0.05)；龍牧807僅在ABA濃度為75 μmol·L-1時高于對照，除50 和100 μmol·L-1ABA濃度外，其它ABA處理組發(fā)芽勢均與對照差異顯著(P<0.05)。

WL343HQ發(fā)芽指數(shù)在ABA濃度為75和100 μmol·L-1時高于對照，除50 μmol·L-1ABA濃度外，其它ABA處理組發(fā)芽勢均與對照差異顯著(P<0.05)；龍牧807發(fā)芽指數(shù)僅在ABA濃度為75 μmol·L-1時高于對照，除100 μmol·L-1ABA濃度外，其它ABA處理組發(fā)芽指數(shù)均與對照差異顯著(P<0.05)。WL343HQ和龍牧807苜蓿種子的活力指數(shù)在各ABA濃度下均高于對照，兩種苜蓿種子的活力指數(shù)除25 μmol·L-1ABA處理濃度外，其它ABA處理組活力指數(shù)均與對照差異顯著(P<0.05)。

2.2.2胚芽長、胚根長、鮮重和干重 經(jīng)不同濃度的ABA緩解處理的受蘇打鹽堿脅迫的WL343HQ和龍牧807芽苗的胚芽長、胚根長、鮮重和干重均隨ABA濃度的增加呈先升后降趨勢，均在75 μmol·L-1時達(dá)到最大值(表2，表3)。在相同ABA濃度下，胚芽長和胚根長均為WL343HQ<龍牧807(100 μmol·L-1ABA除外)，鮮重和干重均為WL343HQ>龍牧807。

WL343HQ和龍牧807胚芽長在各濃度ABA處理均高于對照，兩種苜蓿芽苗的胚芽長在各濃度ABA處理組均與對照差異顯著(P<0.05)，WL343HQ和龍牧807兩種苜蓿芽苗的胚根長在各濃度ABA處理組均高于對照，兩種苜蓿芽苗的胚根長在各濃度ABA處理組均與對照差異顯著(P<0.05)。

WL343HQ和龍牧807兩種苜蓿芽苗的鮮重在各濃度ABA處理下均高于對照，除25μmol·L-1ABA濃度的WL343HQ芽苗的鮮重外，兩種苜蓿在各濃度ABA處理組均與對照差異顯著(P<0.05)。WL343HQ苜蓿芽苗的干重在各濃度ABA處理下均高于對照，龍牧807芽苗的干重在ABA濃度50～100 μmol·L-1時高于對照，除25 μmol·L-1ABA濃度外，兩種苜蓿芽苗的干重在各ABA處理組均與對照差異顯著(P<0.05)。

表2 WL343HQ萌發(fā)指標(biāo)

表3 龍牧807萌發(fā)指標(biāo)

2.3 ABA對苜蓿種子萌發(fā)緩解效果綜合分析

兩種苜蓿種子在ABA緩解處理下種子萌發(fā)的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚芽長、胚根長、鮮重和干重8項形態(tài)指標(biāo)變化不同，應(yīng)用單一指標(biāo)不能準(zhǔn)確反映ABA緩解作用。對不同ABA濃度處理下的兩種苜蓿種子萌發(fā)的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚芽長、胚根長、鮮重和干重的8項指標(biāo)的變化進(jìn)行隸屬函數(shù)值計算，將各項隸屬函數(shù)法累加進(jìn)行綜合分析(見表4)。WL343HQ和龍牧807苜蓿種子萌發(fā)在不同ABA濃度處理下的隸屬值的排序均為：75 μmol·L-1>100 μmol·L-1>50 μmol·L-1>25 μmol·L-1>0 μmol·L-1，不同ABA濃度對蘇打鹽堿脅迫下的苜蓿種子萌發(fā)均產(chǎn)生一定的緩解作用，特別是ABA濃度為75 μmol·L-1時可對蘇打鹽堿脅迫下的苜蓿種子萌發(fā)有較好的緩解作用。

表4 ABA緩解蘇打鹽堿對2種苜蓿種子萌發(fā)及芽苗生長的隸屬函數(shù)值

注：GR，GP，GI，VI，EL，RL，F(xiàn)W和DW分別代表發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚芽長、胚根長、鮮重、干重

Note：GR,GP,GI,VI,EL,RL,FW and DW represent germination rate，germination potential,germination index,vitality index,embryo length,radical length,fresh weight,and dry weight

3 討論

鹽堿脅迫是影響生物生長的重要逆境因素之一，主要通過滲透作用與離子毒害作用對種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用，而堿脅迫對種子萌發(fā)的抑制在鹽脅迫的基礎(chǔ)上，還包括較高的pH值作用，會使種子發(fā)生離子失衡，因此對植物種子的傷害作用更強[7-8]。Na2CO3和NaHCO3等堿性鹽所造成的堿脅迫對植物的破壞作用明顯大于由NaCl和Na2SO4等中性鹽所造成的鹽脅迫。Na2CO3和NaHCO3是內(nèi)陸蘇打鹽堿土的主成分，生長在此類土壤上的植物受到Na+、低水勢和高pH的多重脅迫[9-11]。本試驗的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著蘇打鹽堿濃度的增加，2種苜蓿種子發(fā)芽率降低，但在蘇打鹽堿濃度為20～35 mmol·L-1(WL343HQ)和20～30 mmol·L-1(龍牧807)時的每個處理濃度下的苜蓿種子的發(fā)芽狀況均表現(xiàn)良好，體現(xiàn)了2種苜蓿種子具有一定的抗蘇打鹽堿能力，蘇打鹽堿濃度超過60 mmol·L-1時，2種苜蓿種子的很難萌發(fā)。這與藺吉祥[12]等人研究鹽堿脅迫對紫花苜蓿種子發(fā)芽的協(xié)同影響的結(jié)果一致。

ABA在植物體內(nèi)是一種重要的生長調(diào)節(jié)激素，在植物受到脅迫時，ABA可緩解應(yīng)激脅迫對植物帶來的損害[13]。目前，在ABA緩解高溫、低溫、干旱、鹽脅迫等方面均有研究。本研究利用不同濃度的ABA對苜蓿種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及芽苗的胚芽長、胚根長、鮮重、干重指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果表明供試的外源激素濃度在75～100 μmol·L-1范圍內(nèi)對2種苜蓿種子的萌發(fā)和芽苗早期生長均有顯著促進(jìn)作用。通過試驗研究發(fā)現(xiàn)，ABA可以有效緩解蘇打鹽堿脅迫帶來的負(fù)效應(yīng)，經(jīng)過適宜濃度(75 μmol·L-1)的ABA處理的苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)均較對照提高，也就是說ABA可以使蘇打鹽堿脅迫下的苜蓿種子出芽數(shù)增多，整齊度一致，生長活力提高。ABA的這種正效應(yīng)是維持在一定濃度范圍內(nèi)的，可能是由于激素的正向調(diào)控作用存在一定的范圍。

通常認(rèn)為，ABA可誘導(dǎo)種子的休眠并抑制胚過早萌發(fā)，ABA對某些植物的種子萌發(fā)及幼苗生長發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用[14]。ABA作為脅迫激素還可提高植物對逆境的抵抗能力。研究中在一定蘇打鹽堿濃度下利用不同濃度ABA浸種處理2種苜蓿，能刺激苜蓿芽苗的胚芽、胚根部伸長和生物量積累，這顯示ABA處理對蘇打鹽堿脅迫下幼苗生長具有一定的緩解作用，特別是在ABA濃度為75 μmol·L-1時對2種苜蓿蘇打鹽堿抑制作用有最大的緩解作用。這和彭浩等[15]研究脫落酸對鹽脅迫下玉米種子萌發(fā)和幼苗生長的影響結(jié)果相似。該結(jié)果對蘇打鹽漬化土壤環(huán)境下苜蓿牧場建植有一定的參考作用，應(yīng)用于生產(chǎn)實踐或者其他牧草是否有明顯的緩解效果有待于進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

2種苜蓿種子受蘇打鹽堿脅迫作用降低其種子的發(fā)芽率，WL343HQ和龍牧807苜蓿種子對蘇打鹽堿脅迫的半致死濃度分別為40 mmol·L-1和35 mmol·L-1；ABA作為脅迫因素對2種苜蓿蘇打鹽堿脅迫的種子萌發(fā)和芽苗生長均有促進(jìn)效應(yīng)，ABA浸種可有效提高蘇打鹽堿脅迫下苜蓿種子的萌發(fā)能力，隨著ABA處理濃度的增加，苜蓿在蘇打鹽堿脅迫下的種子萌發(fā)能力逐漸提高，其中以75 μmol·L-1處理效果最好，超過75 μmol·L-1后苜蓿種子的萌發(fā)能力和芽苗生長效果降低。ABA濃度為75 μmol·L-1時，可最大程度的緩解蘇打鹽堿對2種苜蓿種子萌發(fā)的抑制作用。