張珊珊，蒲超，張翼，楊旭，季一飛

急性腦梗死（Acute cerebral infarction，ACI）是一種腦血管疾?。耗X部血管出現(xiàn)狹窄甚至堵塞后，血液循環(huán)出現(xiàn)障礙，腦部供血、供氧中斷，致使組織壞死以及神經(jīng)損傷。ACI以相應(yīng)神經(jīng)功能缺失為臨床表現(xiàn)，具有較高的發(fā)病率、高致殘率和高死亡率，不僅危害病人生命，也加重了家庭和社會的負(fù)擔(dān)［1］。目前，關(guān)于ACI研究的熱點(diǎn)集中在ACI的預(yù)防、降低其致殘率和死亡率。

研究表明，ACI病人和動物模型中的血清微小RNA（miRNA）表達(dá)譜發(fā)生了顯著改變，且miRNA被證實(shí)可參與作用腫瘤細(xì)胞增殖和耐藥。其中miRNA-503作為抑癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用［2］。胰島素樣生長因子1受體（Insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）是一種跨膜受體，屬于酪氨酸激酶受體大家族，可被IGF-1和IGF-2等激活，常在結(jié)直腸癌、胃癌等腫瘤中過表達(dá)，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)化、發(fā)展，并抑制癌細(xì)胞凋亡［3］。miRNA-503可通過調(diào)控IGF-1R的表達(dá)進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡［4］。

腦梗死的發(fā)生可能與惡性腫瘤有關(guān)，被稱為惡性腫瘤相關(guān)腦梗死［5］。為研究miRNA-503在ACI病人體內(nèi)與腫瘤的關(guān)系，本文檢測了ACI病人血清中miRNA-503的表達(dá)水平，并初步分析了其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中對于IGF-1R表達(dá)及調(diào)控PI3K/Akt信號通路的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料選取2017年9月至2019年4月間于南充市中心醫(yī)院確診的92例急性腦梗死病人作為觀察組，其中男性57例，女性35例；年齡范圍為55～72歲，年齡（66.33±2.26）歲；體質(zhì)量范圍為52～61 kg，體質(zhì)量（56.83±2.87）kg。病人均無其他嚴(yán)重并發(fā)癥。同時(shí)挑選同期間于我院體檢健康者92例作為對照組，其中男性55例，女性37例；年齡范圍為52～70歲，平均（64.63±2.77）歲；體質(zhì)量范圍為51～63 kg，體質(zhì)量（57.44±2.96）kg。兩組一般資料比較，均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有病人及其家屬均知情并簽署同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：所有病人的診斷均符合中國腦梗死中西醫(yī)結(jié)合診治指南（2017）［6］的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)過腦血管造影和CT檢查確診［7］。

排除標(biāo)準(zhǔn)：患有嚴(yán)重原發(fā)性疾病者，如肝腎疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、腫瘤、嚴(yán)重感染等；有腦梗死病史者；最近3個(gè)月內(nèi)受嚴(yán)重外傷者；近期接收過重大手術(shù)者。

1.3 樣本采集及處理對照組于體檢當(dāng)日清晨空腹抽取肘靜脈血5 mL。觀察組于入院第2天、禁食10～12 h后清晨空腹抽取肘靜脈血5 mL。室溫放置2 h或4℃過夜后于1 000g離心20 min，分離血清標(biāo)本，密封保存置于-20℃冰箱或者-80℃冰箱保存，避免反復(fù)凍融。

1.4 血清中miRNA-503及IGF-1R的表達(dá)水平分析取觀察組和對照組血清樣品，提取所有樣本RNA后，使用全式金公司的TransScript Two-Step RTPCR SuperMix（AT401-01）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

根據(jù)GeneBank中miRNA-503的序列（NR_030228.1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成miRNA-503引物，F(xiàn)：5′-TGCCCTAGCAGCGGGAA-3′，R：5′-TACCCTGGCAGCGGAAACA-3′。選用U6基因作為內(nèi)參，F(xiàn)：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。將上述cDNA作為模板，按照以下程序在Real-Time PCR儀（ABI 7500，USA）上進(jìn)行qPCR擴(kuò)增：95℃，5 min；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt的方法計(jì)算miRNA-503的相對表達(dá)量。

取對照組和觀察組血清樣本，按照人IGF-1R檢測試劑盒（96T/48T，上海紀(jì)寧酶聯(lián)科技有限公司）的操作說明，對兩組血清樣本中的IGF-1R表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡以將U87細(xì)胞miRNA-503模擬組細(xì)胞和miRNA-503對照組細(xì)胞以7×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液100μL，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，將miRNA-503模擬物以及對照物分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western blot檢測U87細(xì)胞置于加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組細(xì)胞以3.0×105個(gè)/孔的密度接種12孔板，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳：濃縮膠恒壓80 V，20 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部。使用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印槽（Trans-Blot SD，170-3940）在恒壓15 V，30 min條件下轉(zhuǎn)印至PVDV膜（生工，F(xiàn)019532-0010）。取下PVDF膜放入封閉液（TBST，5%脫脂奶粉，pH7.4）中室溫孵育2 h；使用abcam公司生產(chǎn)的IGF-1R一抗稀釋液（ab39398，1∶5 000），Bax一抗稀釋液（ab32503，1：5 000），p-Akt一抗稀釋液（ab38449，1∶5 000），Bcl-xl一抗稀釋液（ab32370，1∶5 000），c-Myc一抗稀釋液（ab32072，1∶5 000），p-STAT3一抗稀釋液（EP2147Y，1∶5 000）室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；使用全式金公司生產(chǎn)的HRP標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG稀釋液（HS101-01，1∶10 000）室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；最后根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光液（180-501，上海天能）使用說明，將PVDF膜置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清樣本中miRNA-503及IGF-1R的表達(dá)量比較觀察組miRNA-503表達(dá)量顯著低于對照組，而IGF-1R的檢測量則顯著高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 急性腦梗死和健康對照血清中miRNA-503及IGF-1R的表達(dá)量

2.2 miRNA-503及IGF-1R在HEB細(xì)胞和U87細(xì)胞中的表達(dá)量比較miRNA-503在HEB細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于U87細(xì)胞（P＜0.05）；IGF-1R在HEB細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于U87細(xì)胞（P＜0.05）。見圖1，表2。

圖1 IGF-1R在腦正常膠質(zhì)細(xì)胞（HEB）及膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中的表達(dá)

表2 miRNA-503及IGF-1R在腦正常膠質(zhì)細(xì)胞（HEB）及膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中的表達(dá)量

2.3 miRNA-503在不同處理的U87細(xì)胞中的表達(dá)量比較3組細(xì)胞中miRNA-503的相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，miRNA-503在空白對照組和陰性對照組的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與兩對照組相比，模擬組細(xì)胞中的miRNA-503的相對表達(dá)量顯著增高（P＜0.05）。見表3。

表3 miRNA-503不同處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中的表達(dá)量

2.4 不同處理的U87細(xì)胞的凋亡情況比較3組細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，空白對照組和陰性對照組的凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與兩對照組相比，模擬組細(xì)胞凋亡率顯著增高（P＜0.05）。見圖2，表4。

2.5 IGF-1R信號通路相關(guān)蛋白在不同處理的U87細(xì)胞中表達(dá)情況比較3組細(xì)胞中的各種蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？瞻讓φ战M和陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對照組相比，IGF-1R、p-Akt、p-STAT3及Bcl-xL等蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）；而c-Myc和Bax的表達(dá)量則顯著升高（P＜0.05）。見圖3，表5。

圖2 三組膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的凋亡情況

表4 不同處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87組中細(xì)胞的凋亡情況

3 討論

ACI的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，涉及多種機(jī)制。臨床檢測表明，患有不同疾病的病人的血漿miRNA表達(dá)不同［8］。多種miRNA在ACI病人血清中存在明顯差異，并發(fā)揮重要功能［9-11］。miRNA屬于非編碼RNA，通常由18～25個(gè)核苷酸組成，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。一般可通過降解靶基因mRNA或者抑制蛋白翻譯等手段對靶基因進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)［12］。目前研究已證實(shí)，miRNA可參與細(xì)胞發(fā)育、分化、生長、增殖以及凋亡等各種生理過程，并且能夠參與調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞和介質(zhì)的表達(dá)［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，ACI病人血清中miRNA-503表達(dá)水平顯著降低，而IGF-1R水平則顯著升高。這表明，miRNA-503及IGF-1R極可能參與了ACI的發(fā)病過程。

圖3 IGF-1R信號通路相關(guān)蛋白在不同處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中表達(dá)

表5 IGF-1R信號通路相關(guān)蛋白在不同處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中表達(dá)/±s

表5 IGF-1R信號通路相關(guān)蛋白在不同處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中表達(dá)/±s

組別空白對照組陰性對照組miRNA-503模擬組F值P值t值（空白對照組比陰性對照組）P值（空白對照組比陰性對照組）t值（空白對照組比miRNA-503模擬組）P值（空白對照組比miRNA-503模擬組）t值（陰性對照組比miRNA-503模擬組）P值（陰性對照組比miRNA-503模擬組）樣本數(shù)5 5 5 IGF-1R 0.93±0.09 0.90±0.10 0.49±0.05 44.000＜0.001 0.499 0.632 9.556＜0.001 8.2000＜0.001 p-Akt 0.76±0.07 0.81±0.09 0.43±0.05 41.260＜0.001 0.981 0.356 8.578＜0.001 8.253＜0.001 c-Myc 0.51±0.06 0.52±0.05 1.07±0.11 84.640＜0.001 0.286 0.782 9.994＜0.001 10.180＜0.001 p-PI3K 1.06±0.09 0.99±0.10 0.30±0.04 134.300＜0.001 1.163 0.278 17.250＜0.001 14.330＜0.001 Bcl-xL 1.12±0.10 1.11±0.10 0.52±0.07 71.100＜0.001 0.158 0.878 10.990＜0.001 10.810＜0.001 Bax 0.44±0.05 0.45±0.04 1.09±0.11 128.400＜0.001 0.349 0.736 12.030＜0.001 12.230＜0.001

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路的激活和相關(guān)免疫功能調(diào)控都與miRNA密切相關(guān)［15-16］。研究表明，多種miRNA都可參與該通路的調(diào)節(jié)［17-18］，且都有IGF-1R的參與［19-21］。IGF-1R是細(xì)胞增殖、分裂以及分化中的重要調(diào)節(jié)因子，能夠預(yù)防各種細(xì)胞的凋亡損傷、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)等［22］，其高表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展明顯相關(guān)［23］。現(xiàn)有的研究表明，miRNA-503參與了多種腫瘤細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)過程［24］，且都靶向IGF-1R發(fā)揮功能［2，4］。

為研究miRNA-503在ACI相關(guān)腫瘤疾病中對IGF-1R及其信號通路中的作用，本研究以人腦正常膠質(zhì)細(xì)胞HEB細(xì)胞及膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞為研究對象，進(jìn)行了初步探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HEB細(xì)胞相比，U87細(xì)胞中miRNA-503表達(dá)水平顯著降低，而IGF-1R水平則顯著升高。進(jìn)一步證實(shí)了miRNA-503及IGF-1R在腫瘤細(xì)胞發(fā)展中起著重要作用。在U87細(xì)胞中過表達(dá)miRNA-503以后，細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。有文獻(xiàn)報(bào)道，IGF-1R活化后，可以激活PI3K、Akt等信號分子，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和遷移能力［22］，Bcl-xl和Bax的表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［25］。本實(shí)驗(yàn)中Western blot結(jié)果顯示，PI3K/Akt信號通路中關(guān)鍵蛋白p-Akt、Bcl-xl和p-PI3K顯著降低，與IGF-1R表達(dá)降低一致；而c-Myc和Bax顯著升高，與細(xì)胞凋亡率增加一致。結(jié)果表明，miRNA-503表達(dá)水平升高，可抑制IGF-1R的表達(dá)，進(jìn)而阻礙了PI3K/Akt信號通路的激活，同時(shí)Bcl-xl/Bax比例下降，共同致使癌細(xì)胞增殖減慢，凋亡增加。

本文尚且存在不足之處：（1）本文僅在細(xì)胞學(xué)水平對miRNA-503對IGF-1R的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步探討，并代替體內(nèi)真實(shí)狀況，需要相關(guān)的動物模型，進(jìn)一步驗(yàn)證本文的結(jié)論。（2）CAI的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，miRNA-503影響的信號通路可能是多方向的，活血也有其他miRNA分子的參與，因此在今后的研究中需要驗(yàn)證其他信號通路的激活及miRNA分子表達(dá)。

綜上所述，在急性腦梗死病人血清中，miRNA-503呈現(xiàn)高水平表達(dá)，而IGF-1R則呈現(xiàn)低水平表達(dá)。miRNA-503在U87細(xì)胞中的過表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖，可能是通過抑制IGF-1R表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路中相關(guān)蛋白表達(dá)，從而抑制了U87的增殖。