王玉輝 郝學喜 崔寶娟

(山東大學第二醫(yī)院 1康復科，山東 濟南 250033；2急診醫(yī)學中心)

神經(jīng)肌肉電刺激(NMES)是利用低頻電流，一般頻率為25～50 Hz，刺激機體特定組織神經(jīng)或肌肉，引起肌肉收縮或抽搐，進而提高肌肉功能，達到修復效果〔1〕。由于NMES其本質是作用于目標肌肉群的神經(jīng)，所以應用NMES的先決條件是目標肌肉群具有完整的神經(jīng)〔2〕。它常用于由于手術、外界傷害等造成的無法進行長期活動的人群，使用NMES儀進行肌肉訓練，進而保持肌肉力量和質量、增加關節(jié)自主活動、促進肌肉自我良好控制，減少痙攣。近年來，除了商用的NMES儀廣泛使用外，家用的NMES儀也已經(jīng)被大量發(fā)展起來，目前正越來越廣泛地應用于各種疾病的康復治療中，病人方便自己獨立使用。但其具體的作用機制，我們仍在不斷探索中〔3〕。

腦血管病包括動脈粥樣硬化、腦血栓等，由于當今社會人們的飲食環(huán)境，血稠、腦組織血液循環(huán)慢等問題暴露，逐漸造成腦組織認知功能減退等癥狀，疾病發(fā)展呈顯著遞增趨勢〔4〕。尤其在老年人群中，患病率更高。有研究發(fā)現(xiàn)，除外界環(huán)境外，機體氧化應激是引起腦部疾病的重要影響因素之一，腦組織氧化還原系統(tǒng)失衡，自由氧產(chǎn)生過多，使缺血性損傷加重〔5〕。因此，有效干預氧化應激也是保護腦組織受損的方法之一。

tau蛋白是微管相關蛋白中含量最高的蛋白，它是神經(jīng)細胞的骨架成分，參與多種細胞功能〔6〕。Tau蛋白含有磷酸基蛋白，若產(chǎn)生腦部疾病，其磷酸化程度加深，常表現(xiàn)為過度磷酸化，會使人喪失正?；顒庸δ堋?〕。本研究旨在探討NMES對腦血管病大鼠模型，神經(jīng)無tau蛋白表達和氧化應激水平的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取健康SPF級雄性SD大鼠30只，體重(252±3.4)g，購買于北京斯貝福生物技術有限公司，由山東大學第二醫(yī)院動物實驗中心自養(yǎng)21 d。隨機均分為三組:空白對照組(B組)，腦血管病模型組(C組)和NMES組(N組)，每組10只。每天正常自由飲水進食，飼喂相同飼料，所有大鼠正常活動，無疾病，適合實驗。鼠房為屏障系統(tǒng)動物房，溫度(25±2)℃，相對濕度50%～60%，每天12 h(8∶00～20∶00)照明。動物實驗的操作與處理由該研究中心動物保健與使用委員會批準，符合國家實驗動物倫理委員會的操作指南，遵循實驗動物倫理要求。

1.2動物實驗飼料 購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心(北京)。

1.3實驗方法

1.3.1腦血管病大鼠模型的建立 大鼠適應性飼養(yǎng)1 w，飼喂普通飼料，觀察其生長情況。從第8天開始造模，腹腔注射麻醉，麻醉劑內容物為12%的水合氯醛，量控制在2.5 ml/kg，避免麻醉過深。SD大鼠經(jīng)麻醉后，將大鼠俯臥放置于動物實驗臺上并將其固定在一個立體分類框架中。C組和N組于大鼠雙側頸總動脈采用結扎的方法建立SD大鼠腦血管病模型。術前禁食12 h，斷水4 h，頸前部去毛、消毒，剪取頸正中央切口，分離雙側頸總動脈，分別用兩股絲線結扎，術后送動物房飼養(yǎng)。造模第3天開始進行NMES治療。N組使用NMS儀對大鼠前肢肌肉進行電刺激，頻率設定100 Hz，電流5～6 mA，脈寬300 ms，1次/d，進行15 min。B組不構建腦血管病模型，亦不進行NMES治療。實驗期間檢測各組大鼠體重、攝食量變化，計算臟器指數(shù)、脂肪系數(shù)和食物利用率等。每天記錄給食量、剩食量和撒食量，每7 d測定一次體重。

1.3.2大鼠狀態(tài)的觀察 觀察造模前后各組大鼠眼睛神態(tài)、毛色變化、攝食量、飲水量、排便排尿量及活動狀況等變化。

1.3.3大鼠Tau 蛋白磷酸化的測定 造模第21天后，各組大鼠用12%的水合氯醛10 mg/kg進行注射，120 ml的生理鹽水快速沖洗，再用偏中性的4%的多聚甲醛每只250 ml注射，隨后速度減慢注射相同劑量。解剖去除腦部組織，使用4%的多聚甲醛浸泡24 h，免疫組化方法進行染色，嚴格按照試劑盒說明進行操作(購買于上海通蔚生物科技有限公司)，光學顯微鏡下進行觀察。

1.3.4實時熒光定量(RT)PCR法測定mRNA相關基因表達 采用Trizol法提取大鼠腦組織總RNA，采用分光光度計法，分別在280 nm波長和260 nm波長吸光度下，計算RNA原液濃度和OD260/OD280。根據(jù)RNA原液濃度及試劑盒說明調整RNA濃度，使RNA稀釋液濃度為500 ng/μl。按試劑盒要求配制反應體系，反應條件為:37℃，15 min；85℃，5 s；4℃，10 min。合成的cDNA保存于-20℃。定性分析腦組織中(PI3K)和(Akt)基因的mRNA含量〔8,9〕。設置引物序列。擴增條件：預變性 95℃ 10 min；變性94℃ 30 s；退火/延伸60℃ 1 min；融解曲線分析94℃ 15 s，60℃ 1 min，94℃ 15 s，60℃ 15 s。反應體系：前引物(5 μmol/L)1 μl，反向引物(5 μmol/L)1 μl，2×PCR 預混液10 μl，DNA模板1 μl，無酶無菌水7 μl。

嚴格按照試劑盒說明書進行操作，結果以2-△△Ct表示。

計算公式如下:

ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組。

1.3.5丙二醛(MDA)含量的測定 大鼠腦組織中MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法進行測定。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行(購自于上海通蔚生物科技有限公司)。

計算公式如下:

1.3.6超氧化物歧化酶(SOD)含量的測定 大鼠腦組織中T-SOD含量采用羥胺法進行測定。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行(購自于上海通蔚生物科技有限公司)。

政府是創(chuàng)新體系的主導者而非獨斷者，因此需要不斷推進體制改革，發(fā)揮組織者的優(yōu)勢，優(yōu)化資源配置，充分利用社會資源，為政府公共服務的創(chuàng)新提供最有力的支持。

計算公式如下:

定義:每毫升反應液中SOD抑制率達到50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位(U)。

1.3.7PI3K和Akt基因蛋白含量的測定 取腦組織后加入細胞裂解液勻漿25 min，4℃，15 000 r/min離心15 min，離心后取組織上清液。嚴格按照二喹啉甲酸(BCA)試劑盒說明測定PI3K和Akt基因蛋白含量。PI3K和Akt檢測試劑盒均購自合肥博美生物科技有限公司。每組取45 μg樣品，加緩沖液使蛋白變性，跑十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將反應條帶進行光密度測定，蛋白表達的相對水平為條帶光密度比值。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1大鼠Tau 蛋白磷酸化表達 經(jīng)測定，與B組相比，C組和N組大鼠Tau蛋白染色較明顯，在C組中表現(xiàn)為過度磷酸化，CA1區(qū)較為明顯(P<0.01)。使用電刺激治療后，N組磷酸化程度明顯減輕(P<0.01)。見表1。

表1 Tau 蛋白磷酸化表達

與對照組比較：1)P<0.05；與肺損傷組比較：2)P<0.05

表2 各組大鼠mRNA的PI3K及Akt基因相對表達量

與B組比較：1)P<0.05；與C組比較：2)P<0.05，下表同

2.3電刺激對大鼠MDA含量和SOD活性的影響 NMES對大鼠MDA含量和SOD活性進行測定。經(jīng)實驗測定發(fā)現(xiàn)，與B組相比，C組和N組MDA含量顯著上升(P<0.05)，電刺激后，N組大鼠呈現(xiàn)下降趨勢(P<0.05)，證明NMES對大鼠MDA含量有緩解的作用。N組大鼠SOD水平較B、C兩組呈現(xiàn)顯著上升趨勢(P<0.05)，電刺激對抗氧化的治療效果較好。見表4。

2.4NMES對PI3K、Akt蛋白含量的測定 通過Western印跡實驗對三組大鼠PI3K、Akt的蛋白表達量及內參物GADPH進行測定?；加心X血管病顯著的抑制了PI3K、Akt的表達(P<0.05)，基因下調。相比之下，電刺激后N組大鼠提高了相關基因蛋白的表達水平(P<0.05)。見圖2、表5。表明N中PI3K、Akt基因與失活的C組模型大鼠相比顯著被激活。

圖1 RT-PCR檢測基因mRNA表達情況

表3 實時熒光定量PCR引物序列

表4 各組大鼠MDA與SOD含量的影響

圖2 各組大鼠PI3K、Akt基因蛋白含量的表達水平

組別PI3KAktB組1.64±0.58 1.83±0.78C組0.74±0.211) 0.85±0.331)N組1.05±0.451)2) 1.26±0.381)2)F/P值23.764/0.00126.460/0.001

3 討 論

腦血管病發(fā)病率和死亡率正逐年上升〔10,11〕。NMES是腦部疾病康復治療的重要手段之一，其有效利用對緩解腦血管病具有重要作用。我們通過促進腦血管病大鼠恢復肢體功能是通過刺激內源性神經(jīng)干細胞增殖而進行的。其作用機制可能與刺激神經(jīng)網(wǎng)絡，增強突觸效能有關〔12～14〕。

Tau蛋白是一類微管相聯(lián)蛋白，具體親水性。雙股螺旋纖維絲(PHF)的主要成分是Tau蛋白，存在于正常神經(jīng)元纖維中，可促進軸突對神經(jīng)遞質的運輸〔15〕。在一個正常成年人體中，tau蛋白是主要的磷酸蛋白，蛋白磷酸化會破壞其結構，導致生物體穩(wěn)態(tài)的改變〔16〕。因此，保護蛋白結構，避免磷酸化具有重要作用。而蛋白磷酸化的程度主要取決于蛋白激酶和蛋白磷酸酶之間的平衡。NMES可減輕tau蛋白的磷酸化原理是降低了蛋白激酶活性，使tau蛋白去發(fā)生脫磷酸作用，最終致使過度磷酸化的tau蛋白生產(chǎn)量減少或使蛋白磷酸酶的活性降低〔17〕。但是我們發(fā)現(xiàn)，自由基的生成使磷酸酶易被氧化，酶活性降低。此外，氧化應激還導致了晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)的生成，AGE可以對tau蛋白進行修飾，修飾后的tau蛋白結構較穩(wěn)定。因此，有效抵抗氧化應激也具有重要作用。本實驗中，神經(jīng)肌肉電刺激能有效清除自由基，可阻止神經(jīng)細胞被自由基破壞。本研究結果說明電刺激可降低大鼠腦中磷酸化tau蛋白的水平并通過清除自由基的途徑抑制氧化應激反應〔18〕。進而證實了自由基的損傷參與了神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化的病理過程。

另外，SOD是體內氧自由基清除的一類重要的抗氧化酶，尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。同時是自由基清除系統(tǒng)的重要組成成分。MDA是脂質過氧化的最終產(chǎn)物，是氧自由基的重要介質可作為評價衰老的重要指標，用來反映氧自由基損傷程度的大小〔19〕。本研究結果表明，氧化應激反應也是引起神經(jīng)元損傷的重要原因。二者與機體氧化還原平衡狀態(tài)密切相關。但是什么導致腦血管病引起的氧化損傷的原因至今尚不清楚，還需做進一步研究驗證說明。

Akt在PI3K/Akt途徑中發(fā)揮著十分重要的作用，它是促細胞生存的一個重要激酶〔20〕。tau蛋白組中的Akt基因被激活，神經(jīng)肌肉電刺激對腦血管病大鼠磷酸化程度有所緩解，Akt能增強GADPH的mRNA的穩(wěn)定性，使GADPH在mRNA和蛋白水平均表現(xiàn)為抑制，可有效降低tau蛋白表達〔21〕，我們猜測其作用機制可能與抑制PI3K/Akt通路的表達有關。本研究的創(chuàng)新點在于首次通過電刺激在PI3K/Akt信號通路中研究神經(jīng)元tau蛋白表達情況和氧化應激水平。