朱愛民，張玉霞，王顯國，劉庭玉，叢百明，王 鑫，候文慧

（1. 內(nèi)蒙古民族大學農(nóng)學院，內(nèi)蒙古 通遼 028041；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學草原與資源環(huán)境學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3. 中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院， 北京 100083）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是一種品質(zhì)高、抗性強的多年生豆科牧草[1]，在我國畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要地位[2-3]。近年來隨著我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整及畜牧業(yè)的快速發(fā)展，各省份紫花苜蓿的種植面積也在不斷擴大，內(nèi)蒙古自治區(qū)提出到2020年結(jié)合其他種類飼草發(fā)展65萬hm2[4]飼草地。科爾沁沙地冬季氣溫低、降雪少，紫花苜蓿普遍存在著越冬率低的問題[5-6]。研究表明，阿魯科爾沁旗除2013年因上年積雪大苜蓿越冬較好外，其他年份均有不同程度的越冬問題[7-8]，2014和2016年苜蓿越冬不足50%，給苜蓿種植企業(yè)及個人帶來重大經(jīng)濟損失，因此，研究紫花苜蓿越冬期的抗寒機理非常重要。

殺霜日(the frost killing period)是指氣溫首次降至-2 ℃的日期[9-10]，朱愛民等[11-12]研究表明殺霜日前后刈割與未刈割苜蓿根頸中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化差異顯著。為適應(yīng)逐漸降低的溫度變化，苜蓿根系會發(fā)生復(fù)雜的生理生化變化以抵御寒冷脅迫。簡令成[13]和Smith[14]研究表明，低溫脅迫會提高植物體內(nèi)的可溶性糖含量。Delauney和Verma[15]研究表明植物體內(nèi)游離脯氨酸含量是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物組織細胞內(nèi)游離脯氨酸含量對維持原生質(zhì)與環(huán)境的滲透平衡具有重要作用。杜永吉等[16]研究表明可溶性蛋白含量與苜?？购猿曙@著正相關(guān)關(guān)系。南麗麗等[17]研究結(jié)果表明，苜蓿根頸中可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸、可溶性糖均隨著溫度降低而增加，隨著溫度的升高而減少的趨勢變化。

國內(nèi)外有關(guān)苜?？购耘c根頸抗氧化酶活性方面的研究資料[18-19]很多，研究表明紫花苜蓿抗寒能力大小一定程度上與其越冬期根系中相關(guān)保護酶活性有關(guān)[20-21]。植物受到低溫脅迫時，細胞內(nèi)的活性氧分子會大量積累，當積累量達到一定量時，膜脂出現(xiàn)過氧化或脫脂化反應(yīng)，此外會引起磷脂游離和細胞膜的結(jié)構(gòu)破壞等癥狀，從而使細胞功能喪失。在此過程中超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)等同工酶能起到一定的抑制過氧化的作用[22-23]，可以減輕活性氧分子對細胞的損害，但當?shù)蜏孛{迫超過一定范圍時，各種同工酶的活性會顯著降低，難以達到抑制作用[24]。馮昌軍等[25]和鄧雪柯等[26]研究表明，當苜蓿受到低溫脅迫時植株體內(nèi)SOD酶活性會明顯提高以消除細胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基的傷害。陶雅等[27]通過對3個紫花苜蓿品種根部丙二醛(MDA)含量動態(tài)變化進行分析，結(jié)果表明溫度下降初期各苜蓿品種根部積累大量的MDA，而后MDA含量降低，隨著溫度的升高，MDA含量又開始逐漸升高。

電導(dǎo)法是判斷植物抗逆性強弱最常用的方法之一。曹紅星等[28]研究表明，相對電導(dǎo)率與脅迫溫度呈負相關(guān)關(guān)系，并由此鑒定不同品種植物的抗寒性及致死溫度。關(guān)于電導(dǎo)法在判斷植物抗寒性上應(yīng)用的報道很多，如小麥(Triticum aestivum)、玉米 (Zea mays)、花菜 ( Brassica oleracea)、黃瓜(Cucumis sativus)、蘋果 (Malus)以及茶 (Camellia sinensis)等其他植物[29]。竇玉梅等[30]研究表明，抗寒性弱的苜蓿品種的細胞膜透性大，而抗寒性強的苜蓿品種細胞膜透性小。近年來在阿魯科爾沁旗種植的苜蓿品種多數(shù)為進口苜蓿品種，其種子用量大、價格昂貴，抗寒能力較差，因此選育高抗寒的國產(chǎn)苜蓿品種至關(guān)重要。本研究中8個苜蓿品種均是國產(chǎn)苜蓿品種，具有較高的研究和利用價值。本研究通過對殺霜日前后苜蓿根頸中生理生化指標的測定，并采用電導(dǎo)法配合Logistic回歸方程計算苜蓿半致死溫度，分析苜蓿根系生理生化指標與半致死溫度的相關(guān)關(guān)系，篩選抗寒指標，探究苜蓿抗寒的生理生化機制，為沙地苜蓿選育高抗寒性品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)自然概況

試驗地在內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市阿魯科爾沁旗草源合作社公司，地理位置為 116°21′ - 120°58′ E，41°17′ - 45°24′ N，溫帶半干旱大陸性氣候。年平均氣溫 0～6 ℃，≥ 10 ℃ 年積溫 3 000～3 200 ℃·d，無霜期140～150 d，年平均降水量350～400 mm，蒸發(fā)量約為降水量的5倍，年平均風速3～4.4 m·s-1。

1.2 供試材料

供試材料見表1所列。

1.3 試驗方法

1.3.1 大田試驗設(shè)計

大田小區(qū)布局及管理：采用隨機區(qū)組設(shè)計，每個苜蓿品種重復(fù)種植3個小區(qū)，8個品種共設(shè)置24個小區(qū)，小區(qū)試驗面積20 m2(5 m × 4 m)，每個小區(qū)之間設(shè)有50 cm過道。2016年8月4日以播種量為 22.5 kg·hm-2播種，試驗田正常管理。于2016年殺霜日前(10月1日)和殺霜日后(10月15日)挖取長勢一致的苜蓿根系，測定根頸中相關(guān)生理生化指標，并取植株頂部(上部)葉片和基部(下部)葉片測定葉綠素和類胡蘿卜素含量。

1.3.2 低溫處理試驗設(shè)計

實驗室低溫處理：11月20號取樣，每小區(qū)取長勢一致的苜蓿越冬器官(根系)若干[29]，低溫處理目標溫度分別為-10、-15、-20、-25、-30和-35 ℃，處理時間為6 h。試驗步驟參照朱愛民等[29]苜蓿低溫處理試驗。

1.4 生理生化指標及根頸電導(dǎo)率測定

游離氨基酸含量采用茚三酮染色法測定[31-33]；游離脯氨酸含量使用茚三酮法測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定；可溶性糖含量和淀粉含量采用蒽酮比色法測定；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定；超氧化物歧化酶活性采用氮藍四唑法測定；過氧化氫酶活性采用紫外吸收法測定；過氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚法測定；葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量采用80%丙酮浸提法測定。

相對電導(dǎo)率測定參照鄒琦等[32]的方法。將各低溫脅迫下的相對電導(dǎo)率值擬合Logistic方程[34-35]，并計算半致死溫度(LT50)。

表1 紫花苜蓿品種及來源Table 1 Alfalfa varieties and sources

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，并做圖和制作表格。采用SPSS17.0軟擬合Logistic方程，并進行方差顯著性及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 沙地苜蓿低溫鍛煉期葉片中葉綠素及類胡蘿卜素含量變化

2.1.1 沙地苜蓿低溫鍛煉期上部葉片中葉綠素及類胡蘿卜素含量變化

10月1日測定8個沙地苜蓿品種上部葉片中葉綠素a和葉綠素b含量均低于10月15日測定的苜蓿上部葉片中葉綠素a和葉綠素b含量，其中農(nóng)菁1號苜蓿上部葉片中葉綠素a和葉綠素b含量增加幅度最大，分別增加0.65和0.29 mg·g-1(表2)。

10月1日測定表明，農(nóng)菁8號苜蓿上部葉片中葉綠素a含量最高，達到0.75 mg·g-1，顯著高于其他苜蓿品種(P ＜ 0.05)，農(nóng)菁1號苜蓿上部葉片中葉綠素a含量顯著低于其他苜蓿品種(P ＜ 0.05)；苜蓿上部葉片中葉綠素b含量和葉綠素最高的均是農(nóng)菁8號品種。農(nóng)菁8號和草原3號苜蓿上部葉片中類胡蘿卜素含量較高，分別為0.31和0.28 mg·g-1(表2)。

表2 苜蓿上部葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量變化Table 2 Changes of chlorophyll and carotenoid content in the upper leaves of alfalfa mg·g-1

10月15日測定表明，苜蓿上部葉片中葉綠素a含量較高的品種是農(nóng)菁8號、農(nóng)菁1號、公農(nóng)1號和草原3號，葉綠素b含量較高的品種是農(nóng)菁8號、農(nóng)菁1號和農(nóng)菁8號；草原2號苜蓿上部葉片中葉綠素含量最低。苜蓿上部葉片中類胡蘿卜素含量最低的是東苜1號品種，為0.21 mg·g-1，但與其他品種相比無差異顯著性(P ＞ 0.05)(表2)。

2.1.2 沙地苜蓿低溫鍛煉期下部葉片中葉綠素及類胡蘿卜素含量變化

10月15日測定沙地苜蓿下部葉片中葉綠素a含量和葉綠素b含量均高于10月1日測定的葉綠素a和葉綠素b含量，其中龍牧801苜蓿下部葉片中葉綠素a和葉綠素b含量增加最多，分別增加0.48和0.29 mg·g-1。10月1日測定沙地苜蓿下部葉片中類胡蘿卜素含量較10月15日測定高(表3)。

10月1日測定農(nóng)菁8號苜蓿下部葉片中葉綠素a含量最高，達到0.73 mg·g-1，顯著高于其他苜蓿下部葉片中葉綠素a含量(P ＜ 0.05)，農(nóng)菁1號苜蓿下部葉片中葉綠素a含量最低，為0.40 mg·g-1。10月15號測定龍牧801苜蓿下部葉片中葉綠素a含量最高，達到1.02 mg·g-1，葉綠素b含量較高的是龍牧801和農(nóng)菁8號苜蓿。10月15日測定苜蓿下部葉片中葉綠素含量較低的品種是草原2號和草原3號，顯著低于其他苜蓿品種(P ＜ 0.05)。苜蓿下部葉片中類胡蘿卜素含量最高的是龍牧801，為0.24 mg·g-1，東苜1號、草原2號和農(nóng)菁1號苜蓿下部葉片中類胡蘿卜素含量較低(表3)。

2.2 沙地苜蓿低溫鍛煉期根頸滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化

2.2.1 沙地苜蓿低溫鍛煉期根頸中可溶性糖含量的變化

如圖1所示，10月1日測定8個苜蓿品種根頸中可溶性糖含量均顯著高于10月15日測定苜蓿根頸中可溶性糖含量(P ＜ 0.05)，說明此時間段苜蓿根頸中可溶性糖含量降低，其中東苜1號和公農(nóng)1號苜蓿根頸中可溶性糖含量降低量較大，分別降低 91.99 和 82.88 mg·g-1。

圖1 苜蓿根頸中可溶性糖含量變化Figure 1 Change of soluble sugar content in root neck of alfalfa

不同時期測定8個苜蓿品種根頸中可溶性糖含量不同。公農(nóng)1號、東苜1號和草原2號根頸中可溶性糖含量在10月1日測定較高，分別為185.24、180.75和 180.00 mg·g-1。10月 15日測定草原 2號和公農(nóng)1號苜蓿根頸中可溶性糖含量較高。

2.2.2 沙地苜蓿低溫鍛煉期根頸中淀粉含量的變化

如圖2所示，除肇東、東苜1號和農(nóng)菁8號外，10月1日測定其他苜蓿品種根頸中淀粉含量均顯著高于10月15日測定的淀粉含量(P ＜ 0.05)，其中增加幅度較大的品種是龍牧801和草原2號，分別增加24.14 和19.59 mg·g-1。10月1日測定僅肇東苜蓿根頸中淀粉含量較10月15日測定的淀粉含量少，但差異未達到顯著水平(P ＞ 0.05)。

圖2 苜蓿根頸中淀粉含量變化Figure 2 Change of starch content in root neck of alfalfa

8個苜蓿品種間根頸中淀粉含量不同。10月1日測定苜蓿根頸中淀粉含量較高的是草原2號和龍牧801品種，分別為86.49和76.22 mg·g-1，肇東苜蓿根頸中淀粉含量最低，為57.24 mg·g-1。10月15日測定農(nóng)菁8號、肇東和農(nóng)菁1號苜蓿根頸中淀粉含量較高，分別為67.14、59.07和55.42 mg·g-1，根頸中含量最低的是草原3號苜蓿，為44.07 mg·g-1。

2.2.3 沙地苜蓿低溫鍛煉期根頸中游離氨基酸含量的變化

根據(jù)圖3可知，沙地苜蓿低溫鍛煉期根頸中游離氨基酸含量變化趨勢不同。10月1日測定龍牧801、肇東、草原3號、公農(nóng)1號和農(nóng)菁8號苜蓿品種根頸中游離氨基酸含量高于10月15日測定的根頸中游離氨基酸含量，但僅公農(nóng)1號達到差異顯著水平(P ＜ 0.05)。10月1日測定草原2號和農(nóng)菁1號苜蓿根頸中游離氨基酸含量顯著低于10月15日測定的根頸中游離氨基酸含量(P ＜ 0.05)。

圖3 苜蓿根頸中游離氨基酸含量變化Figure 3 Change of free amino acid content in root neck of alfalfa

不同時期測定8個苜蓿品種根頸中游離氨基酸含量不同，肇東和公農(nóng)1號苜蓿根頸中游離氨基酸含量10月1日測定較高，分別為2.03和2.02 mg·g-1。10月15日測定草原2號苜蓿根頸中游離氨基酸含量最高，較根頸中游離氨基酸含量最低的農(nóng)菁1號苜蓿高 0.24 mg·g-1。

2.2.4 沙地苜蓿低溫鍛煉期根頸中可溶性蛋白含量的變化

根據(jù)圖4可知，10月1日測定龍牧801、東苜1號、公農(nóng)1號、農(nóng)菁1號和農(nóng)菁8號苜蓿根頸中可溶性蛋白含量顯著高于10月15日測定的可溶性蛋白含量(P ＜ 0.05)。10月1日測定苜蓿根頸中可溶性蛋白含量較高的品種是公農(nóng)1號、農(nóng)菁8號和農(nóng)菁1號苜蓿。10月15日測定苜蓿根頸中可溶性蛋白含量最高的是農(nóng)菁8號苜蓿，達到17.23 mg·g-1，較含量最低的東苜1號苜蓿高3.16 mg·g-1。

圖4 苜蓿根頸中可溶性蛋白含量變化Figure 4 Change of soluble protein content in root neck of alfalfa

2.2.5 沙地苜蓿低溫鍛煉期根頸中C/N變化

根據(jù)圖5可知，除農(nóng)菁8號外，10月1日測定其他苜蓿品種根頸中C/N均高于10月15日測定的C/N，其中龍牧801、肇東、東苜1號、草原2號、草原3號和公農(nóng)1號苜蓿兩次測定根頸中C/N達到差異顯著水平 (P ＜ 0.05)。

不同時期測定8個苜蓿品種根頸中C/N變化不同。草原2號和東苜1號苜蓿10月1日測定根頸中C/N相對較大，分別達12.00和11.13，C/N相對較低的苜蓿品種是農(nóng)菁1號和農(nóng)菁8號，分別是7.91和7.37。10月15日測定東苜1號苜蓿根頸中C/N最高，為9.53，較最低的草原3號苜蓿高3.03。

圖5 苜蓿根頸中C/N變化Figure 5 C/N changes in the root and neck of alfalfa

2.2.6 不同時期測定苜蓿根頸中游離脯氨酸含量的變化

如圖6所示，兩次測定苜蓿根頸中游離脯氨酸含量變化無明顯規(guī)律，10月1日測定龍牧801、肇東、草原2號、公農(nóng)1號、農(nóng)菁1號和農(nóng)菁8號苜蓿根頸中游離氨基酸含量低于10月15日測定的根頸中游離氨基酸含量，但僅肇東苜蓿根頸中游離脯氨酸含量兩次測定達到差異顯著水平(P ＜ 0.05)。10月1日測定草原3號苜蓿根頸中游離脯氨酸含量顯著高于10月15日測定的根頸中游離脯氨酸含量 (P ＜ 0.05)。

圖6 苜蓿根頸中游離脯氨酸含量變化Figure 6 Change of free proline content in root neck of alfalfa

不同時期測定8個苜蓿品種根頸中游離脯氨酸含量變化不同。東苜1號苜蓿10月1日測定根頸中游離脯氨酸含量最高，為118.5 μg·g-1，較根頸中游離脯氨酸含量最低的草原2號高44.2 μg·g-1。10月15測定苜蓿根頸中游離脯氨酸含量較高的苜蓿品種是肇東、東苜1號和龍牧801品種，游離脯氨酸含量較低的是草原2號和草原3號品種。

2.3 不同苜蓿品種低溫鍛煉期根頸抗氧化酶活性變化

2.3.1 沙地苜蓿低溫鍛煉期根頸中SOD活性的變化

如圖7所示，10月15日測定8個苜蓿品種根頸中SOD活性明顯高于10月1日測定的SOD活性，除農(nóng)菁8號外，其他苜蓿品種兩次測定根頸中SOD活性差異均達到顯著水平(P ＜ 0.05)，其中肇東苜蓿10月1日測定苜蓿根頸中SOD活性較10月15日測定的SOD活性增加量最大，增加299.4 U·g-1。

圖7 苜蓿根頸中SOD活性變化Figure 7 Change of SOD activity in root neck of alfalfa

10月1日測定苜蓿根頸中SOD活性最高的是龍牧801品種，達到517.2 U·g-1，肇東苜蓿根頸中SOD活性最低，為287.8 U·g-1。10月15日測定不同苜蓿品種間根頸中SOD活性差異較小，其中苜蓿根頸中SOD活性最大的農(nóng)菁1號品種較根頸中SOD活性最低的農(nóng)菁8號品種高49.7 U·g-1。

2.3.2 沙地苜蓿低溫鍛煉期根頸中CAT活性的變化

根據(jù)圖8所示，10月1日測定龍牧801、肇東和草原3號苜蓿根頸中CAT活性高于10月15日測定的苜蓿根頸中CAT活性，但均未達到差異顯著性水平(P ＜ 0.05)。10月1日測定東苜1號、草原2號、公農(nóng)1號、農(nóng)菁1號和農(nóng)菁8號苜蓿根頸中CAT活性低于10月15日測定的CAT活性，其中東苜1號、草原2號和農(nóng)菁1號品種差異達到差異顯著水平 (P ＜ 0.05)。

10月1日測定苜蓿根頸中CAT活性較高的苜蓿品種是公農(nóng)1號、東苜1號和龍牧801。10月15日測定東苜1號和草原2號苜蓿根頸中CAT活性較強，草原3號苜蓿根頸中CAT活性最弱。

圖8 苜蓿根頸中CAT活性變化Figure 8 Change of CAT activity in root neck of alfalfa

2.3.3 沙地苜蓿低溫鍛煉期根頸中POD活性的變化

根據(jù)圖9所示，8個苜蓿品種根頸中POD活性10月15日測定均高于10月1日測定，除公農(nóng)1號外，其他苜蓿品種根頸中POD活性差異均達到差異顯著水平(P ＜ 0.05)。其中農(nóng)菁1號苜蓿根頸中POD活性兩次測定差異最大，達498.1 U·(min·g)-1。

圖9 苜蓿根頸中POD活性變化Figure 9 Change of POD activity in root neck of alfalfa

10月1日測定公農(nóng)1號苜蓿根頸中POD活性最 大，達 971.1 U·(min·g)-1，其 次 是東苜 1 號 苜蓿。10月15日測定東苜1號、農(nóng)菁1號和農(nóng)菁8號苜蓿根頸中POD活性較大，龍牧801和草原3號苜蓿根頸中POD活性較小。

2.3.4 沙地苜蓿低溫鍛煉期根頸中MDA含量的變化

根據(jù)圖10所示，10月1日測定8個苜蓿品種根頸中MDA含量均顯著高于10月15日測定的根頸中MDA含量(P ＜ 0.05)，其中肇東、東苜1號和龍牧801苜蓿兩次測定根頸中MDA含量差異較大，分別相差 51.8、42.9 和 40.0 nmol·mL-1。

圖10 苜蓿根頸中MDA含量變化Figure 10 Change of MDA content in root and neck of alfalfa

10月1日測定農(nóng)菁8號苜蓿根頸中MDA含量最高，達108.5 nmol·mL-1，較MDA含量最低的東苜1號苜蓿高19.2 nmol·mL-1。10月15日測定苜蓿根頸中MDA含量較低的品種為東苜1號和肇東苜蓿，較高的是農(nóng)菁8號和農(nóng)菁1號品種。

2.4 電導(dǎo)法協(xié)同Logistic回歸方程對8個紫花苜蓿品種半數(shù)致死溫度分析

表4為根據(jù)苜蓿根頸電解質(zhì)滲出率求得logistic回歸方程，8個苜蓿品種半數(shù)致死溫度范圍為-19.45 ℃至-13.11 ℃，其中草原3號半致死溫度最低，農(nóng)菁8號半致死溫度最高；8個苜蓿品種抗寒性排序為草原 3 號 ＞ 東苜 1 號 ＞ 農(nóng)菁 1 號 ＞ 公農(nóng)1 號 ＞ 肇東 ＞ 龍牧 801 ＞ 草原 2 號 ＞ 農(nóng)菁 8 號。

2.5 苜蓿半致死溫度與各生理生化指標相關(guān)性

如表5所示，苜蓿半致死溫度與初秋苜蓿根頸中可溶性糖量和游離脯氨酸含量呈顯著負相關(guān)關(guān)系(P ＜ 0.05)，與苜蓿根頸中MDA含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P ＜ 0.05)。此外，苜蓿根頸中的可溶性蛋白含量與CAT活性和POD活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P ＜ 0.05)，與 C/N 呈顯著負相關(guān)關(guān)系 (P ＞ 0.05),而苜蓿根頸中的可溶性糖含量與游離脯氨酸含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P ＜ 0.01)。

3 討論與結(jié)論

諸多研究表明[10,36-37]，低溫脅迫下苜蓿根和根頸中可溶性糖、可溶性蛋白和游離氨基酸含量增加。本研究表明隨季節(jié)性溫度降低沙地苜蓿根頸中可溶性蛋白含量增加顯著，此研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。與前人研究結(jié)果不同，10月1日測定苜蓿根頸中可溶性糖含量均顯著低于10月15日測定，推斷原因是10月1日后白天氣溫大于5 ℃，苜蓿地上部枝條繼續(xù)生長，消耗根頸中的能源物質(zhì)，根頸中可溶性糖含量降低，導(dǎo)致兩次測定結(jié)果差異較大。脯氨酸含量是一種衡量苜?？购缘闹匾砩笜薣21]。本研究表明10月1日測定肇東根頸中游離氨基酸含量顯著低于10月15日測定的根頸中游離氨基酸含量(P ＜ 0.05)，而10月1日測定東苜1號苜蓿根頸中游離脯氨酸含量顯著高于10月15日測定的根頸中游離脯氨酸含量(P ＜0.05)，其他苜蓿品種間兩次測定結(jié)果無差異顯著性(P ＞ 0.05)，說明在低溫鍛煉期苜蓿根頸中游離脯氨酸含量變化不明顯，此溫度條件下不足以使苜蓿根和根頸受到傷害，因此不會形成為適應(yīng)低溫苜蓿根頸顯著增加游離脯氨酸的反應(yīng)。楊秀娟[38]研究表明隨季節(jié)溫度的降低，苜蓿葉綠素含量降低，光合能力下降。Wise和Naylor[39]研究表明植物受到低溫脅迫后，其葉片中葉綠素的含量會減少，進而產(chǎn)生光抑制，導(dǎo)致光合作用降低。本研究與此研究結(jié)果不同，本研究中隨季節(jié)性降溫苜蓿葉片中葉綠素含量顯著增加，推斷由于溫度降低后苜蓿葉片逐漸失水，導(dǎo)致葉片中色素的積累量增加，從而測得苜蓿葉片中葉綠素含量呈增加的變化趨勢，同時兩次測定公農(nóng)1號和農(nóng)菁8號苜蓿葉片中葉綠素含量均較高。

表4 低溫脅迫下苜蓿根頸相對電導(dǎo)率擬合回歸方程及半數(shù)致死溫度(LT50)Table 4 Fitting regression equation of relative conductivity of alfalfa root neck under low temperature stress and LT50

表5 苜蓿半致死溫度與各生理生化指標相關(guān)性Table 5 Correlation between half lethal temperature and physiological and biochemical indexes of alfalfa

羅新義等[22]研究表明，苜蓿根頸中SOD保護酶已形成一定的耐寒機制，低溫脅迫下苜蓿根頸會通過增強細胞內(nèi)SOD活性使活性氧代謝處于平衡狀態(tài)。鄧雪柯等[26]和朱愛民等[11]研究亦表明，低溫脅迫下苜蓿根頸中的SOD活性會明顯增加?？梢?，苜蓿根頸SOD的高活性有利于苜蓿細胞膜的穩(wěn)定，從而提高苜蓿的抗寒性。本研究與此結(jié)果相同，本研究發(fā)現(xiàn)低溫鍛煉期隨季節(jié)性溫度降低8個苜蓿品種根頸中SOD、POD活性明顯升高，CAT活性變化無統(tǒng)一規(guī)律。其中10月1日測定苜蓿根頸中SOD活性最高的是龍牧801品種，推斷龍牧801品種適應(yīng)低溫能力強。10月1日測定8個苜蓿品種根頸中MDA含量均顯著高于10月15日測定的根頸中MDA含量(P ＜ 0.05)，原因與苜蓿根頸中POD和SOD活性增強有關(guān)。

Lyons[40]認為，當植物受到低溫傷害時，細胞的質(zhì)膜透性會發(fā)生較大的改變，電解質(zhì)會有不同程度的外滲，抗寒性較強的細胞或受害輕的不僅滲透性小，而且滲透性的變化可以逆轉(zhuǎn)，易于恢復(fù)正常。反之，抗寒性弱的細胞或受害重者，不能恢復(fù)正常，甚至造成傷害或死亡，因此相對電導(dǎo)率可作為抗寒性的生理指標。本研究中，電導(dǎo)法協(xié)同Logistic回歸方程表明，草原3號抗寒性最強，其次是東苜1號苜蓿品種，而草原2號和農(nóng)菁8號品種抗寒性分別排在較后；苜蓿半致死溫度與初秋苜蓿根頸中可溶性糖量和游離脯氨酸含量呈顯著負相關(guān)關(guān)系(P ＜ 0.05)，與苜蓿根頸中MDA含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P ＜ 0.05)，即苜蓿根頸中可溶性糖含量越高則半致死溫度越低，游離脯氨酸含量越高半致死溫度越低，苜?？购栽礁撸桓i中MDA含量越高半數(shù)致死溫度越高，抗寒性越弱。本研究結(jié)果與Khedr和Karmouch[37]、韓瑞宏等[41]、張勇等[42]研究結(jié)果相同。

綜上所述，苜蓿根頸中可溶性糖含量、游離脯氨酸含量和MDA含量可作為苜蓿抗寒性指標。植物根頸中可溶性糖含量種類眾多，在感受低溫后哪些類型可溶性糖含量增加，以及引起該類型糖含量增加的分子機制如何，仍需要進一步研究。分析越冬前期苜蓿根頸中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化酶活性的變化有助于進一步了解苜蓿的越冬機制，為后期選育高抗寒品種及植物抗寒性基因提供理論基礎(chǔ)。電導(dǎo)法擬合Logistic方程表明8個紫花苜蓿品種抗寒性強弱排序為：草原3號 ＞ 東苜 1 號 ＞ 農(nóng)菁 1 號 ＞ 公農(nóng) 1 號 ＞ 肇東 ＞ 龍牧 801 ＞草原2號 ＞ 農(nóng)菁8號。建議科爾沁地區(qū)選擇種植抗寒性強的草原3號和東苜1號苜蓿品種。