許亞平　周劍宇　黃珍　李瑾　陳琪　肖春瑩

[摘要] 目的 研究鼻咽癌（NPC）患者頸部淋巴結(jié)在放療前后的超聲變化規(guī)律，探討PD-1在NPC患者治療過程中的作用及單克隆抗體在放射治療NPC中的應(yīng)用。 方法 通過免疫組織化學(xué)染色技術(shù)判斷PD-1的表達(dá)，分析NPC組織中PD-1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。分別對PD-1表達(dá)陰性和陽性的NPC患者應(yīng)用彩色多普勒超聲檢查，同時對普通放療組（對照組）和加入單克隆抗體治療組（實驗組）在放療前后的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的長徑（L）、短徑（S）、長徑/短徑（L/S）、收縮期峰值流速（PSV）、阻力指數(shù)（RI）、血流強(qiáng)度進(jìn)行對比觀察。 結(jié)果 PD-1陰性患者及陽性患者的實驗組和對照組的L、S、PSV和RI指標(biāo)在放療4周后均呈現(xiàn)下降趨勢，而L/S則呈現(xiàn)升高趨勢;治療4周后PD-1陽性患者的實驗組各項超聲指標(biāo)較對照組變化程度明顯增加;血流強(qiáng)度檢測中，PD-1陽性患者的實驗組在治療4周后實驗組0級較對照組比例高，而Ⅱ級較對照組比例小。 結(jié)論 PD-1在NPC治療過程中起著重要的作用，傳統(tǒng)放射治療方法加入單克隆抗體后可以有效提高療效。

[關(guān)鍵詞] 鼻咽癌;多普勒超聲檢查;程序性死亡受體-1;單克隆抗體

[中圖分類號] R739.63;R445.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）23-0039-05

[Abstract] Objective To investigate the ultrasound changes of cervical lymph nodes in patients with nasopharyngeal carcinoma（NPC） before and after radiotherapy， and to explore the role of PD-1 in the treatment of NPC patients and the application of monoclonal antibodies in radiotherapy of NPC. Methods The expression of PD-1 was determined by immunohistochemical staining technique， and the relationship between PD-1 expression and clinicopathological parameters in NPC tissues was analyzed. Color Doppler ultrasonography was performed on NPC patients with negative and positive PD-1 expression， and the long diameter （L）， short diameter （S）， long diameter/short diameter （L/S）， peak systolic velocity （PSV）， resistance index （RI）， and blood flow intensity of the cervical lymph node metastases before and after radiotherapy were compared between the general radiotherapy group （control group） and the monoclonal antibody-treated group （experimental group）. Results The L， S， PSV and RI indexes of PD-1 negative patients and PD-1 positive patients in the experimental group and the control group all showed a downward trend after 4 weeks of radiotherapy， while L/S showed an increasing trend. After 4 weeks of treatment， the ultrasound indexes of the PD-1 positive patients in the experimental group were significantly increased compared with those of the control group. In the blood flow intensity test， the proportion of grade 0 in the experimental group of PD-1 positive patients was higher than that in the control group after 4 weeks of treatment， and the proportion of grade Ⅱ was lower than that of the control group. Conclusion PD-1 plays an important role in the treatment of NPC. The efficacy of traditional radiotherapy can be effectively improved after adding monoclonal antibodies.

[Key words] Nasopharyngeal carcinoma; Doppler ultrasonography; Programmed death receptor-1; Monoclonal antibody

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國最常見的惡性腫瘤之一[1]，其中多數(shù)患者發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在NPC的診治過程中，NPC的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在NPC臨床分期的判斷、治療方案的制定以及預(yù)后評價中起著非常重要的作用[2]。

程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1）及其配體（PD-L1）是目前腫瘤免疫治療的方向之一[3]。PD-1主要在活化T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞表面亦有表達(dá)，PD-L1主要在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)，在樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面亦有表達(dá)，PD-1和PD-L1結(jié)合可抑制T細(xì)胞的活化與增殖，導(dǎo)致腫瘤免疫抑制和免疫逃逸[4]。

目前，包括 BMS-936559等多種針對 PD-L1/PD-1通路阻斷的單克隆抗體用于進(jìn)展期惡性腫瘤的臨床試驗都在進(jìn)行當(dāng)中[5，6]。BMS-936559 是一種高親和力抗人PD-L1單克隆抗體，能夠抑制PD-L1與PD-1、CD80 結(jié)合。近期臨床試驗結(jié)果顯示，抗PD-1和PD-L1單克隆抗體用于治療進(jìn)展期惡性腫瘤療效可觀，且耐受性良好[6]。

本研究采用免疫組化方法檢測NPC組織中PD-1的表達(dá)，分析探討其與NPC患者臨床病理特征。通過藥物阻斷PD-1檢查點，利用彩色多普勒超聲檢查技術(shù)對放療前、后NPC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行監(jiān)測，探討PD-1在NPC治療中的意義及單克隆抗體在放射治療NPC中起到的作用?，F(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料來源

共收集 178例從2013年7月～2018年7月在我院經(jīng)鼻咽鏡活檢和福爾馬林固定石蠟包埋組織病理確診為NPC并且超聲檢查發(fā)現(xiàn)頸部淋巴結(jié)的NPC患者。其中男104例，女74例，年齡25～73歲，平均（44.7±16.5）歲，淋巴結(jié)共計 293 枚。所有病例均是伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶且經(jīng)病理證實的NPC患者[7]，首選治療方案為放射治療且治療前沒有接受其他任何治療。本研究整理的患者基本資料包括性別、年齡、吸煙史、病理類型、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會NPC TNM 分期系統(tǒng)（2010 年第7版），NPC組織標(biāo)本病理類型均為有分化型或未分化型的非角化性癌[8]。

1.2 方法

1.2.1臨床實驗分組? 分別將PD-1陽性和PD-1陰性患者均衡分為實驗組和對照組。普通放療組（對照組）采用60Co 射線體外照射，靶區(qū)體外照射適用于原發(fā)灶及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，劑量為每次DT1.8～2.0 Gy;頻率為每日照射1次，每周照射5次;總劑量限定在70 Gy[7]。實驗組在對照組基礎(chǔ)上每周靜脈注射抗PD-1單克隆抗體（BMS-936559，1 mg/kg），分別于治療前及治療4周后接受頸部淋巴結(jié)彩色多普勒超聲檢查。本研究經(jīng)過我院臨床實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色? （1）組織處理方法：用福爾馬林和石蠟固定包埋后切片、脫蠟、水化、阻斷和修復(fù)處理后，加PD-1一抗，室溫下孵育60 min，再加即用型MaxVision試劑，DAB顯色后蘇木素復(fù)染[9]。（2）免疫組織化學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)：在光鏡下（×400）100個視野計數(shù)，每個視野計數(shù) 100 個細(xì)胞。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比和陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱兩個方面進(jìn)行半定量分析，染色強(qiáng)度分為無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色，當(dāng)陽性細(xì)胞百分比不為0，且染色強(qiáng)度在淡黃色或更深時視為PD-1表達(dá)陽性。

1.2.3 超聲檢測方法? （1）超聲觀察：將淺表器官定為預(yù)設(shè)條件，探頭頻率為7.5～10 MHz，患者充分暴露檢查部位，按順序檢查雙側(cè)頸部，檢查淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的各個超聲參數(shù)（包括具體位置、數(shù)目、形狀等），同側(cè)頸部測量最大淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，測量淋巴結(jié)最大切面的參數(shù)通過脈沖多普勒測量長徑（L）、短徑（S）和長徑/短徑（L/S）。血流參數(shù)包括收縮期峰值流速（PSV）和阻力指數(shù)（RI）。（2）彩色多普勒血流顯像（CDFI）觀察血流分級情況：將血流強(qiáng)度設(shè)定為0～Ⅲ級。信號由弱到強(qiáng)的設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為：無血流信號（0級），淋巴結(jié)內(nèi)探及星點狀或短棒狀閃爍之血流信號（Ⅰ級），淋巴結(jié)內(nèi)探及1～2條棒狀或條狀血流信號（Ⅱ級），淋巴結(jié)探及多條條狀或環(huán)狀、網(wǎng)狀血流信號（Ⅲ級）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料經(jīng)檢驗均屬于正態(tài)分布資料，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1免疫染色結(jié)果

178例NPC患者的組織中PD-1的表達(dá)陽性率為30.3%（54/178），PD-1陰性未見棕黃色或棕褐色顆粒（封三圖1a），PD-1陽性顆粒主要在腫瘤組織間質(zhì)中T淋巴細(xì)胞細(xì)胞漿中（封三圖1b）。結(jié)果顯示，患者年齡、性別、病理類型、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與NPC組織中PD-1的表達(dá)無關(guān)，吸煙可能與PD-1的表達(dá)有關(guān)（P<0.05），見表1。

2.2 放療前、后實驗組和對照組NPC患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶超聲檢查情況

經(jīng)病理及手術(shù)證實，178例NPC患者有293個頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，其中PD-1陽性患者92個頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，PD-1陰性患者201個頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶形狀呈圓形、類圓形或不規(guī)則形。

PD-1陰性患者的實驗組和對照組在放射治療前后L、S、L/S、PSV和RI等超聲指標(biāo)變化明顯，其中兩組患者的L、S、PSV和RI指標(biāo)在放療后均呈現(xiàn)下降趨勢，而L/S則呈現(xiàn)升高趨勢。但是，無論是治療前還是治療后，兩組的各項超聲指標(biāo)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

PD-1陽性患者的實驗組和對照組在放射治療前后L、S、L/S、PSV和RI等超聲指標(biāo)變化明顯，其中兩組患者的L、S、PSV和RI指標(biāo)在放療后均呈現(xiàn)下降趨勢，而L/S則呈現(xiàn)升高趨勢。其中治療前兩組的各項超聲指標(biāo)之間均無顯著性差異;治療4周后實驗組患者的L、S、PSV和RI指標(biāo)明顯低于對照組，而L/S則明顯高于對照組。PD-1陽性患者的實驗組各項超聲指標(biāo)在治療4周后較對照組變化程度明顯增加。見表3。

2.3 NPC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶放療前、后彩色多普勒血流顯像檢查情況

PD-1陽性對照組患者放療前后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶數(shù)目是45 個，治療前血流分級0級占4.4%（2/45），Ⅰ級占20.0%（9/45），Ⅱ級占42.2%（19/45），Ⅲ級占33.3%（15/45）。放療4周后，血流分級0級占68.9%（31/45），Ⅰ級占22.2%（10/45），Ⅱ級占8.9%（4/45），Ⅲ級占0%（0/45）。隨著放療程度的加深，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的血流強(qiáng)度是有顯著變化的，放療前的血流強(qiáng)度分布是趨于Ⅰ～Ⅲ級，放療4周后的血流強(qiáng)度分布是趨于0、Ⅰ級。說明隨著放療程度的逐步加深，血流強(qiáng)度是趨于減弱的，見表4。

PD-1陽性實驗組患者放療前后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶數(shù)目是47個，治療前血流分級0級占4.3%（2/47），Ⅰ級占21.3%（10/47），Ⅱ級占36.2%（17/47），Ⅲ級占38.3%（18/47）。放療4周后，血流分級0級占74.5%（35/45），Ⅰ級占21.3%（10/47），Ⅱ級占4.3%（2/47），Ⅲ級占0（0/47）。放療前的血流強(qiáng)度分布是趨于Ⅰ～Ⅲ級，放療4周后的血流強(qiáng)度分布是趨于0、Ⅰ級。說明隨著放療程度的逐步加深，血流強(qiáng)度是趨于減弱的，見表5。PD-1陽性的實驗組在治療之前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶各血流分級數(shù)目基本均衡，在治療后實驗組0級較對照組比例高，而Ⅱ級較對照組比例小。

3 討論

NPC是我國高發(fā)的惡性腫瘤之一。由于鼻咽腔的淋巴管非常豐富，所以發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是較為普遍的[10]。

PD-1是主要表達(dá)在 T 細(xì)胞上的一種跨膜受體，是在凋亡的 T 細(xì)胞雜交瘤中利用消減法得到的[11]。研究表明PD-1的組織表達(dá)狀態(tài)是預(yù)測PD-1和PD-L1免疫治療的重要標(biāo)志物[12]，在腫瘤組織中主要表達(dá)在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）上。有研究表明，NPC患者中提高CD8+ T淋巴細(xì)胞上PD-1表達(dá)預(yù)后不良[13]。PD-1的配體已被證明有兩個，分別為PD-L1和PD-L2，其中PD-L1是其主要配體[14]。目前已有的研究證實，在多種實體瘤患者病灶局部及外周血免疫細(xì)胞中檢測到PD-L1高表達(dá)，且高表達(dá)PD-L1的患者預(yù)后差，生存率低[15]。

有研究顯示，NPC腫瘤組織中PD-1的表達(dá)陽性率為25%～35%[16]。本研究中PD-1的陽性率為30.3%，與相關(guān)研究結(jié)果相近。本研究顯示PD-1的表達(dá)與年齡、性別、病理類型及分期無相關(guān)性，而是與是否吸煙相關(guān)。吸煙患者的PD-1陽性比例明顯升高，有研究推測是與吸煙導(dǎo)致鼻咽微環(huán)境改變有關(guān)，但目前文獻(xiàn)報道吸煙導(dǎo)致NPC的證據(jù)很少，仍有待進(jìn)一步研究。

彩色多普勒超聲檢查技術(shù)是臨床上檢查淋巴結(jié)病變的一種常規(guī)手段。正常淋巴結(jié)的大小、形態(tài)可以作為區(qū)分良惡性的因素之一[17，18]。研究顯示，超聲檢查中的L/S值在淋巴結(jié)良惡性鑒別中有重要意義。L/S較小時（<2.0）說明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶趨于橢圓形，惡性程度高[18]。本研究結(jié)果顯示，放療4周后PD-1陰性患者的對照組和實驗組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶L、S是趨于減小，L/S是趨于增大。說明經(jīng)過放療后實驗組和對照組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶范圍均有減小，且惡性程度減低。PD-1陽性患者的對照組和實驗組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶變化趨勢與PD-1陰性患者相類似，但是，PD-1陽性患者的實驗組相對于對照組L、S減小和L/S增大的趨勢更明顯，說明抑制了PD-L1與PD-1結(jié)合可以控制NPC在淋巴結(jié)的擴(kuò)散，在采用BMS-936559單克隆抗體阻斷PD-1的放射治療方案可以更有效的減小淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶范圍，且治療后惡性程度更低。

收縮期峰值流速（PSV）及阻力指數(shù)（RI）等相關(guān)血流參數(shù)是判斷腫瘤良惡性的重要依據(jù)[19，20]。本研究結(jié)果顯示，實驗組和對照組的PSV和RI兩項血流參數(shù)均明顯降低，且PD-1陽性患者的實驗組較對照組降低程度增加。說明在PD-1被阻斷后，放射治療對NPC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的血流參數(shù)產(chǎn)生了影響，同樣佐證了阻斷PD-1可以降低NPC惡性程度的結(jié)論。

CDFI在淋巴結(jié)良惡性的鑒別中具有十分重要的臨床意義[21，22]，CDFI血流分級是對于淋巴結(jié)性質(zhì)進(jìn)行鑒別的重要參考依據(jù)。超聲診斷特征分析顯示轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)髓質(zhì)和皮質(zhì)邊界模糊，回聲逐漸減小[23]。本研究中彩色多普勒血流顯像（CDFI）觀察血流分級情況發(fā)現(xiàn)，PD-1陽性患者在放療基礎(chǔ)上應(yīng)用BMS-936559單克隆抗體，血流分級中0級比例升高，而Ⅱ級比例減小。說明在阻斷PD-1檢查點起到了降低淋巴結(jié)血流強(qiáng)度的作用，提高了放射治療的效果。

綜上，PD-1的表達(dá)對NPC的惡性程度有較大影響，同時阻斷PD-1檢查點對NPC的放射治療起到重要的作用。

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（收稿日期：2018-11-30）