劉 青，邱 波，孟令軍，仉 偉，黃永紅，傅苗裔，謝緒昌

(1.濟(jì)南動(dòng)物園，山東濟(jì)南250031；2. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東濟(jì)南250101)

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)(Haemonchuscontortus)屬于毛圓科、血矛屬，是寄生在羊等反芻動(dòng)物皺胃和小腸內(nèi)的一種寄生蟲(chóng)[1]，可誘發(fā)貧血、消瘦、生理機(jī)能紊亂等慢性消耗性癥狀，幼年動(dòng)物急性感染易導(dǎo)致死亡。

本園人工飼養(yǎng)的歐洲盤(pán)羊?yàn)槿吼B(yǎng)， 其中3只幼年個(gè)體相繼出現(xiàn)精神萎靡不振、食欲降低、糞便稀薄如水等癥狀。捕捉后頸靜脈采血進(jìn)行血液常規(guī)檢測(cè)，顯示紅細(xì)胞總數(shù)6.27×1012/L，血紅蛋白55 g/L，呈貧血狀。翌日清晨死亡1只，剖檢可見(jiàn)皺胃內(nèi)有大量活動(dòng)的粉白色線狀寄生蟲(chóng)，黏膜彌漫性出血，內(nèi)容物呈粉紅色；瓣胃及十二指腸前段亦可見(jiàn)少量蟲(chóng)體，其他器官未見(jiàn)明顯眼觀病變。取另2只幼年個(gè)體新鮮糞便進(jìn)行鏡檢觀察，可見(jiàn)大量已開(kāi)始孵化的幼蟲(chóng)卵，糞便蟲(chóng)卵數(shù)量約1.2×104個(gè)/g。

1 材料

1.1 病料 對(duì)死亡盤(pán)羊進(jìn)行剖檢，取皺胃內(nèi)成蟲(chóng)進(jìn)行形態(tài)特征及鏡檢觀察，-20 ℃保存；取皺胃組織用中性福爾馬林溶液固定保存。

1.2 主要試劑 快速DNA提取檢測(cè)試劑盒、2×TaqPCR Mastermix,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；福爾馬林、伊紅、蘇木素等,購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 PCR引物 采用嚴(yán)若峰等[2]設(shè)計(jì)的引物P18S、P5.8SDW和 P5.8UP、P28S分別對(duì)血矛線蟲(chóng)的ITS1和ITS2片段序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增(P18S: 5′-GTAACAAGGTATCTGTAGGT-3′,P5.8SDW:5′-ATCGATACGCGAATCAACCG-3′；P5.8UP：5′-GCATAGCGCCGTTGGGTT-3′,P28S:5′-GGCTTCTCCCCGTTCACA-3′)，預(yù)期擴(kuò)增片段的大小分別為500 bp和400 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 方法

2.1 蟲(chóng)體的形態(tài)學(xué)觀察 取長(zhǎng)短不同的蟲(chóng)體放置載玻片上，顯微鏡鏡檢觀察，根據(jù)形態(tài)區(qū)分雌雄個(gè)體。

2.2 蟲(chóng)體的PCR檢測(cè)

2.2.1 模板DNA提取 取低溫保存的雄蟲(chóng)、雌蟲(chóng)，分別放入1.5 mL離心管中，加入50 μL緩沖液B1，用研磨杵充分研磨至溶液渾濁，加入50 μL緩沖液B2，震蕩混勻，12 000 r/min離心2 min，吸取上清液于另一干凈的1.5 mL離心管中作為模板備用。

2.2.2 ITS序列的擴(kuò)增 建立20 μL反應(yīng)體系：2×TaqPCR Mastermix 10 μL，ddH2O 7 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板2 μL。

擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

電泳及成像：將所得PCR產(chǎn)物5 μL及DL-2 000 Marker加入1.2% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，電壓100 V，30 min后成像系統(tǒng)拍照觀察結(jié)果。

2.2.3 序列測(cè)定與分析 將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與NCBI中的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

2.3 病理學(xué)觀察 將中性福爾馬林固定的組織進(jìn)行修整，常規(guī)方法制作石蠟切片，經(jīng)H.E.染色后對(duì)病變部位進(jìn)行鏡檢觀察。

3 結(jié)果與分析

3.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 經(jīng)測(cè)量雄蟲(chóng)體長(zhǎng)約2～3 cm，鏡檢可見(jiàn)交合傘分3葉，背葉小呈圓形，兩側(cè)葉發(fā)達(dá)；交合刺一對(duì)呈楔形，其近端較寬，遠(yuǎn)端窄小，末端膨大成1小結(jié)；雌蟲(chóng)可達(dá)3 cm以上，腹部?jī)?nèi)充滿蟲(chóng)卵的子宮和腸管盤(pán)繞呈雙色螺旋狀，陰門(mén)位于蟲(chóng)體后部(見(jiàn)中插彩版圖1)。

3.2 PCR檢測(cè)結(jié)果 PCR產(chǎn)物成像結(jié)果分別在400 bp和500 bp處有一條帶(見(jiàn)圖2)，與預(yù)期結(jié)果一致，判定為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)。將兩段序列分別與NCBI上的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示雌蟲(chóng)ITS1同源性在95%，雄蟲(chóng)同源性92%；雌雄個(gè)體ITS2片段同源性均較高，達(dá)98%。

圖2 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)ITS1、ITS2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

1：雌蟲(chóng)ITS1序列；2：雄蟲(chóng)ITS1序列；M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；3：雌蟲(chóng)ITS2序列；4：雄蟲(chóng)ITS2序列

3.3 病理學(xué)觀察結(jié)果 鏡檢顯示低倍鏡下，皺胃黏膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，黏膜固有層內(nèi)及黏膜間存在多灶性的蟲(chóng)體及蟲(chóng)卵。高倍鏡下，蟲(chóng)體及蟲(chóng)卵周?chē)猩倭垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)，周?chē)南袤w組織未見(jiàn)明顯的變性、壞死等病理學(xué)變化(見(jiàn)中插彩版圖3)。

4 討論

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)ITS序列在種內(nèi)相對(duì)保守，目前ITS序列分析已經(jīng)在寄生蟲(chóng)及其他病原鑒定和分類中發(fā)揮了重要作用[3-4], 是種間鑒定的理想遺傳標(biāo)記，可以作為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的分子鑒別標(biāo)志之一。本試驗(yàn)中分離所得的歐洲盤(pán)羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)ITS2序列與NCBI中公布的其他序列具有較高的同源性，雌雄個(gè)體在ITS1片段的保守型表現(xiàn)的差異尚需進(jìn)一步研究，兩段序列均可與其他毛圓科屬線蟲(chóng)相區(qū)分。

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)口囊內(nèi)有一圈長(zhǎng)矛狀的牙齒也被稱為背齒，可咬住宿主的胃壁，在吸血時(shí)前端刺入黏膜內(nèi)，可使胃腸的黏膜層受損[5]。本試驗(yàn)中對(duì)皺胃病變部位的鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)，蟲(chóng)體及蟲(chóng)卵周?chē)南袤w組織并未見(jiàn)明顯的變性、壞死等病理學(xué)變化，說(shuō)明胃腸功能損傷不是引起宿主急性死亡的主要原因，及時(shí)有效改善貧血、補(bǔ)充體液、驅(qū)蟲(chóng)可以達(dá)到良好的治療效果。根據(jù)臨床治療結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常規(guī)劑量的驅(qū)蟲(chóng)藥物使用效果不理想，這與蟲(chóng)體耐藥性和藥物質(zhì)量等因素有關(guān)[6]，保證安全的前提下，可加大藥物使用劑量，對(duì)病重個(gè)體前期應(yīng)以營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)液消炎為主。

本次捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的感染可能與采食含有蟲(chóng)卵的新進(jìn)鮮草有關(guān)，當(dāng)季雨水豐富，利于寄生蟲(chóng)的孵化繁殖，因此在以后的工作中應(yīng)注意對(duì)鮮草的寄生蟲(chóng)檢測(cè)，尤其是新來(lái)源的牧草更應(yīng)加強(qiáng)重視,避免外源性感染蟲(chóng)卵的攝入。