思彬彬+張學(xué)娟+張靠穩(wěn)

摘要：以南方根結(jié)線蟲雌蟲DNA為基礎(chǔ)，通過ISSR-PCR分子標(biāo)記鑒別出寄生在黃瓜和番茄上的南方根結(jié)線蟲。本試驗中ISSR-PCR反應(yīng)體系25 μL，各因素的最佳濃度分別為：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+ 2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物0.3 μmol/L、DNA 140 ng。 通過對50個ISSR引物的篩選，得到1個引物841，該引物能將寄生在不同寄主上的南方根結(jié)線蟲加以鑒別。

關(guān)鍵詞：南方根結(jié)線蟲；雌蟲；ISSR-PCR；鑒別；引物

中圖分類號： S432.4+5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0035-01

南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）是一種分布廣、危害嚴(yán)重的植物寄生線蟲[1]，通過其在侵染的寄主植物上的寄生行為直接引起作物的產(chǎn)量損失。傳統(tǒng)方法主要根據(jù)根結(jié)線蟲形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定和分類，但由于其較大的變異性導(dǎo)致有時結(jié)果不夠準(zhǔn)確[2]。本試驗將南方根結(jié)線蟲形態(tài)學(xué)和 ISSR-PCR 分子標(biāo)記的方法相結(jié)合，研究了賀蘭山軍馬場不同寄主上南方根結(jié)線蟲中種群的種類，為今后寧夏地區(qū)南方根結(jié)線蟲病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 南方根結(jié)線蟲樣本的采集

2012年1月在賀蘭山軍馬場溫棚采集有大量根結(jié)的黃瓜根部組織；2012年7月分別在賀蘭山軍馬場露天采集有大量根結(jié)的番茄根部組織。

1.2 南方根結(jié)線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

依據(jù)參考文獻(xiàn)[2]，分別觀察黃瓜和番茄根結(jié)中的根結(jié)線蟲雌蟲會陰花紋。

1.3 2種寄主根部南方根結(jié)線蟲DNA的提取

提取方法根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]

1.4 2種不同寄主上南方根結(jié)線蟲的ISSR-PCR擴(kuò)增

利用單因素試驗與正交設(shè)計試驗相結(jié)合的方法，建立并優(yōu)化了根結(jié)線蟲ISSR-PCR的體系。適用于南方根結(jié)線蟲的25 μL ISSR-PCR反應(yīng)體系中各因素的最佳濃度分別為：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物 0.3 μmol/L、DNA 140 ng。

1.5 黃瓜與番茄根部南方根結(jié)線蟲的ISSR-PCR鑒別

將取自黃瓜和番茄根部的南方根結(jié)線蟲采用ISSR-PCR分子標(biāo)記，利用50個引物進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

依據(jù)參考文獻(xiàn)[2]的方法，鑒別出所采黃瓜和番茄的根部樣本中的根結(jié)線蟲均為南方根結(jié)線蟲。同時前人的研究結(jié)果也顯示該地區(qū)的根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲。

2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

由圖1 可知，以不同寄主上的南方根結(jié)線蟲DNA為模板，利用ISSR-PCR分子標(biāo)記的方法，使用不同的引物對其進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果顯示，雖然形態(tài)學(xué)上雌蟲的會陰花紋觀察發(fā)現(xiàn)寄生在黃瓜和番茄根部的根結(jié)線蟲均為南方根結(jié)線蟲，但是利用ISSR-RCR分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，南方根結(jié)線蟲在不同寄主上卻存在差異性。本試驗中篩選了50個引物，發(fā)現(xiàn)1個引物對不同寄主上的南方根結(jié)線蟲擴(kuò)增后存在差異性。

2.3 鑒別結(jié)果

在篩選的50個ISSR引物中，其中有1個引物841擴(kuò)增的結(jié)果顯示兩者之間存在差異性（圖2）。來自不同寄主的南方根結(jié)線蟲，其會陰花紋均具背弓較高的特點，但其DNA水平上卻存在差異。A泳道均為黃瓜根部的南方根結(jié)線蟲，B泳道均為番茄根部的南方根結(jié)線蟲，而引物841能將二者鑒別開來。

3 討論

一直以來，會陰花紋在鑒定根結(jié)線蟲的種的效果方面是值得肯定的；但是，很多研究顯示，會陰花紋存在較大的變異性，而ISSR-PCR能夠幫助彌補會陰花紋變異所帶來的鑒定局限性。與此同時，南方根結(jié)線蟲具有4個生理小種，也有可能在不同的寄主上寄生的是不同的生理小種。而本次試驗采集黃瓜和番茄根部樣品的季節(jié)不同，黃瓜是在冬季蔬菜溫棚中采集的根部樣本，而番茄卻是在7月份的露天大田里采集的根部樣本，所以，筆者推斷ISSR-PCR結(jié)果之所以有差異性，可能是不同的生理小種造成的。以往對南方根結(jié)線蟲生理小種的鑒別依據(jù)是鑒別寄主，本試驗結(jié)果提示以后可以考慮利用ISSR-PCR鑒別南方根結(jié)線蟲的生理小種；并且本試驗結(jié)果也可為今后寧夏地區(qū)根結(jié)線蟲病害的防治提供一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃 利，王 宇，董林林，等. 南方根結(jié)線蟲與秀麗線蟲同源基因的鑒定及其應(yīng)用分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，15（4）：45-50.

[2]廖金鈴，蔣 寒，孫龍華，等. 中國南方地區(qū)作物根結(jié)線蟲種和小種的鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，22（6）：544-548.

[3]思彬彬，張靠穩(wěn)，孟北乾. 雌根結(jié)線蟲DNA的提取方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（6）：27-28.

摘要：以南方根結(jié)線蟲雌蟲DNA為基礎(chǔ)，通過ISSR-PCR分子標(biāo)記鑒別出寄生在黃瓜和番茄上的南方根結(jié)線蟲。本試驗中ISSR-PCR反應(yīng)體系25 μL，各因素的最佳濃度分別為：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+ 2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物0.3 μmol/L、DNA 140 ng。 通過對50個ISSR引物的篩選，得到1個引物841，該引物能將寄生在不同寄主上的南方根結(jié)線蟲加以鑒別。

關(guān)鍵詞：南方根結(jié)線蟲；雌蟲；ISSR-PCR；鑒別；引物

中圖分類號： S432.4+5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0035-01

南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）是一種分布廣、危害嚴(yán)重的植物寄生線蟲[1]，通過其在侵染的寄主植物上的寄生行為直接引起作物的產(chǎn)量損失。傳統(tǒng)方法主要根據(jù)根結(jié)線蟲形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定和分類，但由于其較大的變異性導(dǎo)致有時結(jié)果不夠準(zhǔn)確[2]。本試驗將南方根結(jié)線蟲形態(tài)學(xué)和 ISSR-PCR 分子標(biāo)記的方法相結(jié)合，研究了賀蘭山軍馬場不同寄主上南方根結(jié)線蟲中種群的種類，為今后寧夏地區(qū)南方根結(jié)線蟲病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 南方根結(jié)線蟲樣本的采集

2012年1月在賀蘭山軍馬場溫棚采集有大量根結(jié)的黃瓜根部組織；2012年7月分別在賀蘭山軍馬場露天采集有大量根結(jié)的番茄根部組織。

1.2 南方根結(jié)線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

依據(jù)參考文獻(xiàn)[2]，分別觀察黃瓜和番茄根結(jié)中的根結(jié)線蟲雌蟲會陰花紋。

1.3 2種寄主根部南方根結(jié)線蟲DNA的提取

提取方法根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]

1.4 2種不同寄主上南方根結(jié)線蟲的ISSR-PCR擴(kuò)增

利用單因素試驗與正交設(shè)計試驗相結(jié)合的方法，建立并優(yōu)化了根結(jié)線蟲ISSR-PCR的體系。適用于南方根結(jié)線蟲的25 μL ISSR-PCR反應(yīng)體系中各因素的最佳濃度分別為：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物 0.3 μmol/L、DNA 140 ng。

1.5 黃瓜與番茄根部南方根結(jié)線蟲的ISSR-PCR鑒別

將取自黃瓜和番茄根部的南方根結(jié)線蟲采用ISSR-PCR分子標(biāo)記，利用50個引物進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

依據(jù)參考文獻(xiàn)[2]的方法，鑒別出所采黃瓜和番茄的根部樣本中的根結(jié)線蟲均為南方根結(jié)線蟲。同時前人的研究結(jié)果也顯示該地區(qū)的根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲。

2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

由圖1 可知，以不同寄主上的南方根結(jié)線蟲DNA為模板，利用ISSR-PCR分子標(biāo)記的方法，使用不同的引物對其進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果顯示，雖然形態(tài)學(xué)上雌蟲的會陰花紋觀察發(fā)現(xiàn)寄生在黃瓜和番茄根部的根結(jié)線蟲均為南方根結(jié)線蟲，但是利用ISSR-RCR分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，南方根結(jié)線蟲在不同寄主上卻存在差異性。本試驗中篩選了50個引物，發(fā)現(xiàn)1個引物對不同寄主上的南方根結(jié)線蟲擴(kuò)增后存在差異性。

2.3 鑒別結(jié)果

在篩選的50個ISSR引物中，其中有1個引物841擴(kuò)增的結(jié)果顯示兩者之間存在差異性（圖2）。來自不同寄主的南方根結(jié)線蟲，其會陰花紋均具背弓較高的特點，但其DNA水平上卻存在差異。A泳道均為黃瓜根部的南方根結(jié)線蟲，B泳道均為番茄根部的南方根結(jié)線蟲，而引物841能將二者鑒別開來。

3 討論

一直以來，會陰花紋在鑒定根結(jié)線蟲的種的效果方面是值得肯定的；但是，很多研究顯示，會陰花紋存在較大的變異性，而ISSR-PCR能夠幫助彌補會陰花紋變異所帶來的鑒定局限性。與此同時，南方根結(jié)線蟲具有4個生理小種，也有可能在不同的寄主上寄生的是不同的生理小種。而本次試驗采集黃瓜和番茄根部樣品的季節(jié)不同，黃瓜是在冬季蔬菜溫棚中采集的根部樣本，而番茄卻是在7月份的露天大田里采集的根部樣本，所以，筆者推斷ISSR-PCR結(jié)果之所以有差異性，可能是不同的生理小種造成的。以往對南方根結(jié)線蟲生理小種的鑒別依據(jù)是鑒別寄主，本試驗結(jié)果提示以后可以考慮利用ISSR-PCR鑒別南方根結(jié)線蟲的生理小種；并且本試驗結(jié)果也可為今后寧夏地區(qū)根結(jié)線蟲病害的防治提供一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃 利，王 宇，董林林，等. 南方根結(jié)線蟲與秀麗線蟲同源基因的鑒定及其應(yīng)用分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，15（4）：45-50.

[2]廖金鈴，蔣 寒，孫龍華，等. 中國南方地區(qū)作物根結(jié)線蟲種和小種的鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，22（6）：544-548.

[3]思彬彬，張靠穩(wěn)，孟北乾. 雌根結(jié)線蟲DNA的提取方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（6）：27-28.

摘要：以南方根結(jié)線蟲雌蟲DNA為基礎(chǔ)，通過ISSR-PCR分子標(biāo)記鑒別出寄生在黃瓜和番茄上的南方根結(jié)線蟲。本試驗中ISSR-PCR反應(yīng)體系25 μL，各因素的最佳濃度分別為：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+ 2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物0.3 μmol/L、DNA 140 ng。 通過對50個ISSR引物的篩選，得到1個引物841，該引物能將寄生在不同寄主上的南方根結(jié)線蟲加以鑒別。

關(guān)鍵詞：南方根結(jié)線蟲；雌蟲；ISSR-PCR；鑒別；引物

中圖分類號： S432.4+5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0035-01

南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）是一種分布廣、危害嚴(yán)重的植物寄生線蟲[1]，通過其在侵染的寄主植物上的寄生行為直接引起作物的產(chǎn)量損失。傳統(tǒng)方法主要根據(jù)根結(jié)線蟲形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定和分類，但由于其較大的變異性導(dǎo)致有時結(jié)果不夠準(zhǔn)確[2]。本試驗將南方根結(jié)線蟲形態(tài)學(xué)和 ISSR-PCR 分子標(biāo)記的方法相結(jié)合，研究了賀蘭山軍馬場不同寄主上南方根結(jié)線蟲中種群的種類，為今后寧夏地區(qū)南方根結(jié)線蟲病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 南方根結(jié)線蟲樣本的采集

2012年1月在賀蘭山軍馬場溫棚采集有大量根結(jié)的黃瓜根部組織；2012年7月分別在賀蘭山軍馬場露天采集有大量根結(jié)的番茄根部組織。

1.2 南方根結(jié)線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

依據(jù)參考文獻(xiàn)[2]，分別觀察黃瓜和番茄根結(jié)中的根結(jié)線蟲雌蟲會陰花紋。

1.3 2種寄主根部南方根結(jié)線蟲DNA的提取

提取方法根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]

1.4 2種不同寄主上南方根結(jié)線蟲的ISSR-PCR擴(kuò)增

利用單因素試驗與正交設(shè)計試驗相結(jié)合的方法，建立并優(yōu)化了根結(jié)線蟲ISSR-PCR的體系。適用于南方根結(jié)線蟲的25 μL ISSR-PCR反應(yīng)體系中各因素的最佳濃度分別為：dNTPs 0.24 mmol/L、Mg2+2.1 mmol/L、Taq酶10.4 U、引物 0.3 μmol/L、DNA 140 ng。

1.5 黃瓜與番茄根部南方根結(jié)線蟲的ISSR-PCR鑒別

將取自黃瓜和番茄根部的南方根結(jié)線蟲采用ISSR-PCR分子標(biāo)記，利用50個引物進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

依據(jù)參考文獻(xiàn)[2]的方法，鑒別出所采黃瓜和番茄的根部樣本中的根結(jié)線蟲均為南方根結(jié)線蟲。同時前人的研究結(jié)果也顯示該地區(qū)的根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲。

2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

由圖1 可知，以不同寄主上的南方根結(jié)線蟲DNA為模板，利用ISSR-PCR分子標(biāo)記的方法，使用不同的引物對其進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果顯示，雖然形態(tài)學(xué)上雌蟲的會陰花紋觀察發(fā)現(xiàn)寄生在黃瓜和番茄根部的根結(jié)線蟲均為南方根結(jié)線蟲，但是利用ISSR-RCR分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，南方根結(jié)線蟲在不同寄主上卻存在差異性。本試驗中篩選了50個引物，發(fā)現(xiàn)1個引物對不同寄主上的南方根結(jié)線蟲擴(kuò)增后存在差異性。

2.3 鑒別結(jié)果

在篩選的50個ISSR引物中，其中有1個引物841擴(kuò)增的結(jié)果顯示兩者之間存在差異性（圖2）。來自不同寄主的南方根結(jié)線蟲，其會陰花紋均具背弓較高的特點，但其DNA水平上卻存在差異。A泳道均為黃瓜根部的南方根結(jié)線蟲，B泳道均為番茄根部的南方根結(jié)線蟲，而引物841能將二者鑒別開來。

3 討論

一直以來，會陰花紋在鑒定根結(jié)線蟲的種的效果方面是值得肯定的；但是，很多研究顯示，會陰花紋存在較大的變異性，而ISSR-PCR能夠幫助彌補會陰花紋變異所帶來的鑒定局限性。與此同時，南方根結(jié)線蟲具有4個生理小種，也有可能在不同的寄主上寄生的是不同的生理小種。而本次試驗采集黃瓜和番茄根部樣品的季節(jié)不同，黃瓜是在冬季蔬菜溫棚中采集的根部樣本，而番茄卻是在7月份的露天大田里采集的根部樣本，所以，筆者推斷ISSR-PCR結(jié)果之所以有差異性，可能是不同的生理小種造成的。以往對南方根結(jié)線蟲生理小種的鑒別依據(jù)是鑒別寄主，本試驗結(jié)果提示以后可以考慮利用ISSR-PCR鑒別南方根結(jié)線蟲的生理小種；并且本試驗結(jié)果也可為今后寧夏地區(qū)根結(jié)線蟲病害的防治提供一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃 利，王 宇，董林林，等. 南方根結(jié)線蟲與秀麗線蟲同源基因的鑒定及其應(yīng)用分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，15（4）：45-50.

[2]廖金鈴，蔣 寒，孫龍華，等. 中國南方地區(qū)作物根結(jié)線蟲種和小種的鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，22（6）：544-548.

[3]思彬彬，張靠穩(wěn)，孟北乾. 雌根結(jié)線蟲DNA的提取方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（6）：27-28.