張安東, 王 磊, 陶榆瑋, 宋麗菊, 成 娟,易思君, 吳道艷, 黃 敏, 趙 建*

(1. 四川大學 生命科學學院, 四川 成都 610064； 2. 四川省原子能研究院 輻照保藏四川省重點實驗室, 四川 成都 610101)

石韋(Pyrrosiapetiolosa)始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》,屬于水龍骨科多年生常綠植物,在傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)中常用于治療腎炎、膀胱炎、尿結(jié)石、肺性氣管炎、吐血、尿血[1-3],且在羌族民間常被用作外敷上藥來治療病原菌引起的傷口感染.近年來許多研究者報道,相較于化學合成法,植物中提取的化學成分對于拮抗耐藥S.aureus有顯著效果[4-6].有研究證實P.petiolosa提取物中含有槲皮素、木犀草素、皂苷、山奈酚等組分,也含有豐富的黃酮類和蒽醌類化合物,這些化合物均有較好的抗菌活性[7-8].但是,目前有關(guān)P.petiolosa活性成分研究較多,抑菌效果及提取條件優(yōu)化研究較少.本文通過正交試驗優(yōu)化提取條件,同時通過抑菌圈大小、最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)來評估P.petiolosa酯提物(PPEAE)對S.aureus拮抗效果,為進一步研究其抑菌機制及后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ).

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是典型的常見革蘭氏陽性菌,更是一種人畜共患且嚴重危害人類健康的病原菌[9-12].當今世界,由S.aureus感染所引起的各類疾病日趨嚴重,同時該菌所產(chǎn)生引起食物中毒的腸毒素更是世界性難題[13].為有效遏制其蔓延和治療相關(guān)感染引起的疾病,大量抗生素被開發(fā)和生產(chǎn),然而伴隨著抗生素的濫用,導(dǎo)致多種耐藥S.aureus的出現(xiàn)[14],尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)(MRSA),該菌在食品、醫(yī)院、畜牧業(yè)變得愈發(fā)流行,極大地威脅著人類健康,且目前無非常有效控制的方法與治療手段[15-16].因此,研究開發(fā)和尋找新型抗菌劑的任務(wù)已迫在眉睫.

1 材料與儀器

1.1 植物P.petiolosa采自四川省阿壩藏族羌族自治州汶川縣綿虒鎮(zhèn),經(jīng)四川大學植物學白潔副教授鑒定,陰干處理3 d后4 ℃冷藏保存?zhèn)溆?

1.2 菌株金黃色葡萄球菌(S.aureus)由四川大學資源微生物學及微生物技術(shù)四川省重點實驗室提供并保藏.

1.3 試劑酵母粉、胰蛋白胨購自O(shè)xoid公司;甘油、氯化鈉、瓊脂粉、乙酰乙酯購自蜀都化驗設(shè)備有限公司;鏈霉素、紅霉素購自Sigma公司;乙醇購自成都科龍化工集團.

1.4 儀器LDZX-30KB型滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠),1389型生物安全柜(Thermo),HPS-250型恒溫培養(yǎng)箱(哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠),DK-8D型電熱恒溫三孔水浴鍋(上海躍進醫(yī)療器械有限公司),R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司),BCD-160TMPQ型冰箱(海爾).

2 方法

2.1 主要溶液和試劑的配制

2.1.1PPEAE制備 稱取陰干3 d的P.petiolosa葉片200 g,剪碎后放入具塞廣口瓶中,加入4 000 mL乙酸乙酯浸泡3 d后過濾,濾液在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至終質(zhì)量濃度2 g/mL(原葉質(zhì)量),酯提物經(jīng)0.22 μm微孔濾膜除菌后于4℃冰箱保存?zhèn)溆肹17].

2.2 提取方法單因素實驗及正交優(yōu)化

2.2.1不同質(zhì)量濃度的選擇 準確向7個藍口瓶中分別加入250、500、750、1 000、1 250、1 500和1 750 mL乙酸乙酯,每瓶加入50 g陰干3 d的P.petiolosa葉片,室溫浸泡5 d,終產(chǎn)物通過旋蒸濃縮至終質(zhì)量濃度1 g/mL(原葉質(zhì)量).

2.2.2不同溫度的選擇 在P.petiolosa質(zhì)量濃度為1/20 g/mL的條件下,6個藍口瓶中均加50 g陰干3 d的P.petiolosa葉片,分別在4、25、40、50、60和70 ℃恒溫水浴下浸泡5 d,旋蒸濃縮至終質(zhì)量濃度為1 g/mL(原葉質(zhì)量).

2.2.3不同時間的選擇 在P.petiolosa質(zhì)量濃度為1/20 g/mL、提取溫度為50 ℃的條件下,向6個藍口瓶中分別加入50 g陰干3 d的P.petiolosa葉片,恒溫水浴下分別浸泡1～6 d,旋蒸濃縮至終質(zhì)量濃度為1 g/mL(原葉質(zhì)量)[18].

2.2.4提取條件的正交優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以PPEAE對S.aureus抑菌圈大小為指標,以提取工藝中質(zhì)量濃度(A)、提取溫度(B)和提取時間(C)為因素設(shè)立3水平,選取L9(33)正交表(表1)的試驗法優(yōu)化最佳提取工藝條件[19].

2.3 PPEAE對S.aureus抑菌拮抗活性測定采用牛津杯法和倍比稀釋法,并繪制生長曲線,分別檢測PPEAE的抑菌活性.將過夜活化的S.aureus稀釋至1×106CFU/mL,取100 μL菌懸液涂布至LB平板.將不同質(zhì)量濃度PPEAE分別吸取130 μL加入至放置在涂有S.aureus的平板牛津杯中,37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h后測量抑菌圈直徑,以乙酸乙酯和LB培養(yǎng)基、紅霉素和鏈霉素分別作為陰性對照組與陽性對照,16 h后測量抑菌圈大小(包括6 mm的牛津杯在內(nèi))[20-21].96孔板1～14孔中加入100 μL LB液體培養(yǎng)基,向第一個孔中加入1 g/mL PPEAE 100 μL,再依次進行倍比稀釋直至第十二孔,分別向1～12孔加入100 μL過夜重懸的S.aureus菌液,第十三和第十四孔加入200 μL培養(yǎng)基和菌液作為對照.將最小抑菌濃度及兩邊的孔涂平板,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,平板上無菌落生長的處理濃度即為MBC[22].

表 1 正交設(shè)計試驗因素與水平表

2.4 PPEAE拮抗S.aureus生長變化測定向A、B 2個裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中分別加入1 mLS.aureus菌液,37 ℃培養(yǎng),在對數(shù)生長期向A錐形瓶中加入使得終質(zhì)量濃度為MIC的PPEAE,B瓶作為對照,37 ℃、150 r/min培養(yǎng),每2 h取3 mL培養(yǎng)液測定600 nm處吸光值,取各個實驗OD600平均值繪制生長曲線[23].

2.5 PPEAE作用于S.aureus后菌體形態(tài)的測定分別向4支含有S.aureus菌液離心管中加入1/2 MIC PPEAE、MIC PPEAE、生理鹽水、乙酸乙酯,37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h.8 000 r/min離心3 min后PBS緩沖液洗滌,加入質(zhì)量分數(shù)3%戊二醛,放入4 ℃冰箱固定24 h.8 000 r/min離心3 min后PBS洗滌,用質(zhì)量分數(shù)30%～100%不同梯度乙醇脫水20 min,加入乙酸異戊醋置換2次,每次20 min.將處理后菌液滴50 μL于0.5 cm2的蓋玻片上,冷凍干燥1 h后將樣品置于電鏡載物臺觀察.

3 結(jié)果

3.1 提取方法單因素實驗

3.1.1不同質(zhì)量濃度條件下浸提所得PPEAE對S.aureus拮抗效果影響 由圖1可知,質(zhì)量濃度分別為1/5、1/10、1/15、1/20、1/25、1/30和1/35 g/mL,常溫浸提5 d的條件下,PPEAE對S.aureus的抑菌效果隨質(zhì)量濃度的提高先增強后減弱,在1/20 g/mL時抑菌圈達到最大值26 mm.

圖 1 不同質(zhì)量濃度浸提所得PPEAE對S. aureus的拮抗效果

3.1.2不同溫度條件下浸提所得PPEAE對S.aureus抑菌效果的影響 由圖2可知,在其他條件一定時,50 ℃浸提PPEAE對S.aureus抑菌效果最好,溫度小于50 ℃時,PPEAE對S.aureus抑菌效果隨溫度的增加而提高,溫度大于50 ℃時,PPEEA對S.aureus抑菌效果隨溫度的增加而減弱.

圖 2 不同溫度浸提所得PPEAE對S. aureus的拮抗效果

3.1.3不同時間條件下浸提所得PPEAE對S.aureus抑菌效果的影響 由圖3可知,隨著浸泡時間的延長,抑菌效果逐漸增強,浸泡5 d所得PPEAE對S.aureus抑菌圈直徑為30.8 mm.隨著時間的再延長,抑菌效果變化不顯著,因此,選取5 d作為最適提取時間.

圖 3 不同時間浸提所得PPEAE對S. aureus的抑菌效果

3.2 提取優(yōu)化后PPEAE對S.aureus的抑菌效果由表2數(shù)據(jù)分析可知,在9種試驗方法中,試驗組6對S.aureus的拮抗作用最強,抑菌圈直徑可達35.67 mm.但在不同因素水平下綜合評價:根據(jù)K1值可知,質(zhì)量濃度1/20 g/mL>1/25 g/mL>1/15 g/mL;根據(jù)K2值可知,溫度60 ℃>40 ℃>50 ℃;根據(jù)K3值可知,浸泡時間5 d>4 d>6 d;根據(jù)極差(R)大小判斷可知B>C>A.因此,在3種因素中,提取溫度是影響PPEAE對S.aureus抑菌效果最大因素,其次是提取時間,最后是質(zhì)量濃度.綜合考慮各因素可最終確定PPEAE對S.aureus抑菌效果的最佳提取方案是A2B3C2.

表 2 L9(33)正交提取優(yōu)化后PPEAE對S. aureus的抑菌效果

3.3 PPEAE對S.aureus抑菌活性測定通過牛津杯法評估PPEAE的抑菌效果,由圖4可看出,隨著PPEAE質(zhì)量濃度的增加,PPEAE對S.aureus抑菌圈直徑從8 mm增加到24 mm.相同質(zhì)量濃度下,PPEAE抑菌圈大于鏈霉素,PPEAE抑菌活性較好.

圖 4 不同質(zhì)量濃度PPEAE與抗生素對S. aureus抑菌效果比較

3.4 PPEAE對S.aureus的MIC和MBC值的測定進一步對PPEAE作用的抑菌效果進行探究,通過檢測PPEAE對S.aureus的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)數(shù)據(jù)顯示,MIC和MBC值分別為7.8和15.6 mg/mL,拮抗效果較好.

3.5 生長曲線測定由圖5可以看出,對照組S.aureus在4 h進入對數(shù)期,18 h生物量達到最高,20 h開始進入衰亡期.PPEAE與S.aureus共培養(yǎng)后,S.aureus生長明顯受到抑制,相較于正常組其抑制率在24 h時達到83.69%.對比兩組生長曲線可知,PPEAE可在MIC處理條件下顯著抑制S.aureus的生長.

圖 5 PPEAE作用S. aureus的生長曲線

3.6 PPEAE作用S.aureus形態(tài)變化從圖6可看出,正常組S.aureus菌落完整,細胞結(jié)構(gòu)完整,細胞壁分布均勻、形態(tài)飽滿、結(jié)構(gòu)清晰、完整光滑,未有細胞破損情況,呈葡萄球狀(A);與正常組相比,陰性對照組無顯著變化(B);1/2 MIC PPEAE作用于S.aureus后,形態(tài)發(fā)生改變,菌體表面粗糙出現(xiàn)凹痕(C);MIC PPEAE作用于S.aureus后,菌體部分表面有凹陷,出現(xiàn)不規(guī)則褶皺、形狀不規(guī)則、無飽滿感,細胞壁、胞膜損傷[24](D).

4 討論

通過對P.petiolosa酯提物提取條件進行優(yōu)化,分別以質(zhì)量濃度、提取溫度、提取時間3個單因素下提取所得的PPEAE對S.aureus的抑菌活性進行了測定,并根據(jù)單因素試驗的所得結(jié)果進行正交優(yōu)化試驗,最終得到最佳提取條件是質(zhì)量濃度1/20 g/mL、提取溫度60 ℃、提取時間5 d.采用牛津杯法測定了PPEAE對S.aureus體外抗菌活性,與相同濃度下的抗生素相比,PPEAE拮抗S.aureus的作用效果要強于鏈霉素,稍弱于紅霉素.在PPEAE最小抑菌濃度條件下處理S.aureus后,相較于對照組,其生長、繁殖受到明顯抑制.SEM結(jié)果顯示,PPEAE處理后的S.aureus菌體表面不平整,部分菌體表面出現(xiàn)凹陷、皺縮,且有少量囊泡狀不規(guī)則突起,與其他的抗菌劑作用后的S.aureus的結(jié)果相類似[24].可能原因是PPEAE中某些活性化合物作用于菌體后會對S.aureus菌體細胞造成一定的損傷與影響[25].因此,可以看出PPEAE具有較強的拮抗S.aureus活性.

綜上所述,Pyrrosiapetiolosa中的活性成分可在較為簡易的條件下被乙酸乙酯所提取,且在體外試驗中展示出較高效的拮抗S.aureus活性.本實驗對P.petiolosa提取條件的優(yōu)化以及其拮抗S.aureus作用效果的初步研究,不僅為開發(fā)新的抗菌藥物提供方向,也為進一步研究PPEAE活性成分與拮抗S.aureus分子機制研究奠定基礎(chǔ).