謝智彬 謝光宇 馮耀寧 黃恒前 翁旋任 付偉金

1廣西醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院泌尿外科（南寧530021）；2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科（南寧530021）

膀胱癌是泌尿系腫瘤中常見的惡性腫瘤［1-2］，在我國的發(fā)病率逐年上升，其發(fā)生、發(fā)展主要受環(huán)境及遺傳相關(guān)因素的影響，主要分為非浸潤型膀胱癌和浸潤型膀胱癌［3］，非浸潤型膀胱癌主要以經(jīng)尿道膀胱腫物切除術(shù)為主，術(shù)后灌注化療等綜合治療［4-5］。因膀胱癌具有易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移特性，約30%非浸潤型膀胱癌患者復(fù)發(fā)進展為浸潤型膀胱癌，而根治性膀胱切除是浸潤型膀胱癌治療的金標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后生存質(zhì)量以及預(yù)后欠佳［6］。隨著分子技術(shù)的快速發(fā)展，分子靶向治療腫瘤已成為目前研究熱點，因此，尋找能準(zhǔn)確預(yù)測腫瘤的發(fā)生以及監(jiān)測腫瘤進展的分子靶點具有重要意義。

吡咯啉-5-羧酸還原酶1（pyrroline-5-carboxylate reductase 1，PYCR1）是一種參與細(xì)胞代謝的活性酶，是脯氨酸生物合成中的最終酶［7-8］。早期主要研究發(fā)現(xiàn)人類PYCR1 的突變與皮膚松弛、早衰以及抗氧化應(yīng)激活、線粒體調(diào)節(jié)密切相關(guān)［9-11］。然而對于其與腫瘤的關(guān)系報道相對較少，近年來隨著對PYCR1 研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在多種實體腫瘤中異常表達(dá)［8，12-13］，但在膀胱癌中的表達(dá)情況目前尚未明確，故本研究探討PYCR1 在膀胱癌患者中的表達(dá)情況及其臨床意義，為臨床治療及未來精準(zhǔn)靶向藥物治療膀胱癌提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年10月至2018年1月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的初診膀胱癌患者43 例，其中男30 例，女13 例，平均年齡64.3（45～78）歲，低級別14 例，高級別29 例。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或生物等治療，術(shù)后經(jīng)病理檢查證實為膀胱癌，術(shù)中均留取膀胱癌組織及癌旁組織。所有標(biāo)本均在離體后30 min 內(nèi)放置-80 ℃冰箱中保存。下載癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome.nih.gov/）中膀胱癌表達(dá)PYCR1 相關(guān)的RNA-Seq 數(shù)據(jù)和匹配的臨床數(shù)據(jù)資料，共入426 例膀胱癌樣本，其中癌與癌旁組織配對19 例。所有標(biāo)本均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，并與患者家屬簽署相關(guān)知情同意書。

1.2 膀胱癌和癌旁組織中PYCR1 mRNA 表達(dá)檢測采用實時熒光定量PCR 技術(shù)（real time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測PYCR1 mRNA 表達(dá)。具體步驟：采用mRNA 提取試劑盒（Sigma 公司）按照說明書步驟在低溫環(huán)境下提取標(biāo)本總mRNA，采用分光光度儀的OD260/OD280評估所提取的mRNA 的質(zhì)量，并計算mRNA 濃度。根據(jù)mRNA 濃度按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara 公司）要求稀釋配比后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后采用RT-PCR擴增膀胱癌及癌旁組織中PYCR1 mRNA 表達(dá)。PYCR1 引物及內(nèi)參β-actin 均由武漢金開瑞生物工程有限公司設(shè)計并合成。PYCR1 引物上游5′-GAAGATGGGGGTGAAGTTGA - 3′ ，下 游5′ - CTCAATGGAGCTGATGGTGA-3′；β-actin 引物上游5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min、94 ℃變性20 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。所有試驗均獨立重復(fù)3 次。

1.3 膀胱癌及癌旁組織中PYCR1蛋白檢測采用SP 免疫組化染色法。兔抗人PYCR1 購自Abcam公司，免疫組化SP 試劑盒和DAB 顯色試劑盒均購買于北京中杉金橋公司。收集膀胱癌及癌旁手術(shù)標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定24 ～48 h，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片，采用0.01 mmol/L 枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)，室溫自然冷卻，加入內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑10 min，PBS 沖洗3 次，分別加入單抗，4 ℃恒溫箱孵育過夜，PBS 液沖洗3 次，加二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸顯色。最后由兩位高年資病理科醫(yī)生行雙盲在顯微鏡下對結(jié)果進行判斷，PYCR1 陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色細(xì)顆粒狀。按染色的強度的深淺評分：0 分無染色；1 分淡黃色；2 分棕黃色；3 分棕褐色。按陽性細(xì)胞百分比評分：1 分：1%～10%；2 分：10%～50%；3 分：50%～80%；4 分：＞80%，接著按染色強弱與陽性細(xì)胞的乘積積分，≥4 分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 23.0 軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以（）表示，計量資料組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PYCR1 在TCGA 數(shù)據(jù)庫中膀胱癌的表達(dá)情況結(jié)果發(fā)現(xiàn)TCGA 數(shù)據(jù)庫中總體407 例膀胱癌樣本中的癌和19 例癌旁組織PYCR1 的mRNA 表達(dá)水平分別為（9.984±1.614）和（7.529±1.087），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），同時配對的19 對膀胱癌患者和癌旁組織的PYCR1 的mRNA 表達(dá)水平分別為（10.166±1.073）和（7.529±1.087），同樣差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。而PYCR1 的mRNA表達(dá)水平與TCGA 總樣本的臨床病理特征的關(guān)系詳見表1，發(fā)現(xiàn)PYCR1 高表達(dá)與年齡（χ2= 9.064，P=0.003）、病理分級（χ2=18.133，P＜0.001）、N 分期（χ2= 13.439，P＜0.001）、T 分期（χ2= 4.681，P=0.03）和M 分期（χ2= 5.569，P= 0.018）、臨床分期（χ2= 14.303，P＜0.001）有關(guān)，但與性別不相關(guān)（P＞0.05）。見表1。

2.2 膀胱癌和癌旁組織中PYCR1 mRNA 表達(dá)比較本研究收集的膀胱癌與癌旁組織中PYCR1 mRNA 表達(dá)量分別為（5.81 ± 1.46）、（4.93 ± 1.37），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），同時發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者的PYCR1 mRNA 表達(dá)的與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），認(rèn)為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期的膀胱癌患者的PYCR1 mRNA 表達(dá)量較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和早期的膀胱癌患者高，但與患者的性別、年齡、病理分級、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均未發(fā)現(xiàn)有關(guān)聯(lián)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中膀胱癌樣本的PYCR1 mRNA 表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between PYCR1 mRNA expression and clinicopathological features in bladder cancer samples from TCGA database 例

2.3 膀胱癌和癌旁組織中PYCR1 蛋白表達(dá)情況免疫組化結(jié)果示，PYCR1 陽性染色主要定位在細(xì)胞核內(nèi)，呈現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒狀。見圖1～4。PYCR1 蛋白在膀胱癌組織中表達(dá)陽性率為58.14%，在癌旁組織中表達(dá)的陽性率為16.28%（χ2=16.125，P＜0.001），說明膀胱癌組織中PYCR1蛋白的表達(dá)明顯高于癌旁組織。分析PYCR1 的表達(dá)與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者癌組織PYCR1 蛋白表達(dá)的升高與臨床分期（χ2= 4.341，P= 0.037）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2= 4.838，P= 0.028）相關(guān)，PYCR1 蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膀胱癌中陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膀胱癌（90.9%vs.46.9%，P＜0.05）；PYCR1 蛋白在臨床分期T2～T4期膀胱癌中的陽性率高于Ta～T1 期膀胱癌的陽性率（83.3%vs.48.4%，P＜0.05），但與患者的性別、年齡、病理分級、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

圖1 膀胱癌組織的HE 染色圖（×100）Fig.1 HE staining of bladder cancer tissue（×100）

圖2 癌旁膀胱組織的HE 染色圖（×100）Fig.2 HE staining of paracancerous bladder tissue（×100）

圖3 PYCR1 在膀胱癌組織的表達(dá)（×100）Fig.3 Expression of PYCR1 in bladder cancer tissues（×100）

圖4 PYCR1 在癌旁膀胱組織的表達(dá)（×100）Fig.4 Expression of PYCR1 in adjacent bladder tissues（×100）

表2 PYCR1 的表達(dá)量與膀胱癌患者臨床病理特征關(guān)系Tab.2 Relationship between expression of PYCR1 and clinicopathological features of bladder cancer patients

3 討論

膀胱癌是泌尿系疾病中常見的腫瘤，具有發(fā)病率高、臨床治療療效及患者預(yù)后較差的特性，但其發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，其中可能涉及許多腫瘤相關(guān)因子的參與和調(diào)控。因此，如何進一步探究膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找可靠的生物標(biāo)志物以及有效的分子治療靶點對提高膀胱癌患者診斷及預(yù)后意義重要。

PYCR1 是一種代謝相關(guān)的酶，在脯氨酸生物合成中起關(guān)鍵作用，是脯氨酸生物合成中的最終酶，其作用是催化NAD（P）H 依賴性還原吡咯啉-5-羧酸酯生成脯氨酸。早期主要研究發(fā)現(xiàn)人類PYCR1 的突變與皮膚松弛、早衰以及抗氧化應(yīng)激活、線粒體調(diào)節(jié)密切相關(guān)。而對于其與腫瘤的關(guān)系目前報道相對較少，研究表明PYCR1 與肺癌、前列腺癌、乳腺癌等發(fā)生、進展存在密切聯(lián)系。CAI 等［12］研究發(fā)現(xiàn)PYCR1 在非小細(xì)胞肺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與患者的預(yù)后密切相關(guān)，證實高表達(dá)PYCR1 的肺癌患者相關(guān)性總生存時間明顯差于PYCR1 低表達(dá)患者，通過沉默PYCR1 后，肺癌細(xì)胞株的增殖能力明顯受到抑制，并誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，認(rèn)為PYCR1 可作為抑制肺癌細(xì)胞增殖的新型治療靶標(biāo)。DING 等［8］研究發(fā)現(xiàn)PYCR1 在mRNA和蛋白水平與乳腺癌患者腫瘤的大小、臨床分級以及分型密切相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)高表達(dá)PYCR1 的患者的生存預(yù)后明顯較低表達(dá)的患者差，使用RNA干擾抑制PYCR1 表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞的生長及侵襲能力明顯下降，同時增強了多柔比星在乳腺癌細(xì)胞株中的細(xì)胞毒性，認(rèn)為PYCR1 可作為乳腺癌治療的潛在靶點。在泌尿系腫瘤中情況，ZENG等［13］研究發(fā)現(xiàn)PYCR1 在前列腺癌組織中呈高表達(dá)，并其表達(dá)量與前列腺癌患者的年齡、Gleason評分相關(guān)，通過慢病毒介導(dǎo)敲除前列腺癌細(xì)胞株DU145、PC-3、LNCap 后，癌細(xì)胞的增殖及集落形成能力明顯下降，其原因可能是增強細(xì)胞凋亡和G2/M 期阻滯，同時發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)蛋白顯著增加，認(rèn)為PYCR1可能作為治療前列腺癌良好的潛在靶點。然而PYCR1 在膀胱癌的表達(dá)情況目前尚未明確，故本研究通過結(jié)合TCGA 數(shù)據(jù)庫及收集43 例膀胱癌患者的癌組織和癌旁組織中mRNA 和蛋白水平表達(dá)情況，探討PYCR1 在膀胱癌患者的表達(dá)情況以及與患者臨床特征間的關(guān)系，為臨床治療及未來精準(zhǔn)靶向藥物治療膀胱癌患者提供進一步的基礎(chǔ)研究依據(jù)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，首先通過TCGA 數(shù)據(jù)庫分析表明膀胱癌組織中PYCR1 的mRNA 表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，并且發(fā)現(xiàn)PYCR1 高表達(dá)與年齡、病理分級、N 分期、T 分期和M 分期、臨床分期密切相關(guān)。同時本研究通過qRT-PCR 技術(shù)證實膀胱癌組織中PYCR1 mRNA 的相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織，與TCGA 數(shù)據(jù)庫結(jié)果相一致，免疫組化實驗還發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中的PYCR1 蛋白的陽性率顯著高于癌旁組織，說明膀胱癌組織中PYCR1 基因mRNA 和蛋白的表達(dá)水平顯著升高。同時，通過分析PYCR1 的表達(dá)與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者癌組織PYCR1 蛋白表達(dá)的升高與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，認(rèn)為PYCR1 蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膀胱癌中陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移膀胱癌；PYCR1 蛋白在臨床分期T2-T4 期膀胱癌中的陽性率高于Ta～T1 期膀胱癌的陽性率，但與患者的性別、年齡、病理分級、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均未發(fā)現(xiàn)有關(guān)聯(lián)，與PYCR1 在mRNA 表達(dá)水平得出的結(jié)論相一致。但其確切的機制目前尚未明確，故筆者擬建立過表達(dá)及沉默PYCR1 的膀胱癌細(xì)胞株模型，探討其參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展的機制研究。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PYCR1 在膀胱癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，并與膀胱癌患者的臨床病理特征具有一定的相關(guān)性，提示PYCR1 可能參與了膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展，為膀胱癌的基因靶向治療提供一個新的思路。