劉茂茂 鄭相如 歐陽(yáng)瑤

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸一科（貴州遵義563000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種發(fā)病機(jī)制尚不明確且嚴(yán)重危害人類健康的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其具有高患病率、高致殘率、高病死率［1］。許多研究表明患有自身免疫性疾病的患者合并COPD 的概率增高，免疫的紊亂也許會(huì)進(jìn)一步加重COPD 病程［2］，此揭示COPD 也許是自身免疫性疾病中的一種［3］。

輔助性T細(xì)胞和樹突細(xì)胞（dendritic cells，DCs）是參與COPD 的重要免疫細(xì)胞。Th17 分泌IL-22、IL-21、IL-17 及影響IL-23 等細(xì)胞因子加入到炎癥和自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展中［4］。Treg 通過(guò)分泌IL-10 和TGF-β 等抗炎及抑制性細(xì)胞因子參與并維持免疫穩(wěn)態(tài)及耐受［5］。據(jù)報(bào)道，COPD 氣道放大的炎癥反應(yīng)與Th17 及Treg 異常反應(yīng)有關(guān)，Th17/Treg 的失衡及相關(guān)細(xì)胞因子參與了COPD 發(fā)病機(jī)制［6］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Th17/Treg 失衡及DCs 在COPD 發(fā)病中扮演重要角色［7］。DCs 能捕獲、遞呈抗原到初始的T 細(xì)胞，其對(duì)特異性免疫應(yīng)答起到一個(gè)很關(guān)鍵的作用［8］。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子（suppressors of cytokine signaling，SOCS）蛋白能參與到負(fù)性調(diào)節(jié)酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT）信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，主要傳導(dǎo)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，參與免疫調(diào)節(jié)，其中SOCS1 能影響DCs 分化及功能［9］。報(bào)道示過(guò)表達(dá)SOCS1 使DCs 偏向imDCs，減低T 細(xì)胞的活性，呈現(xiàn)免疫耐受，從而參與自身免疫性疾?。?］，但COPD 中尚未報(bào)道。鑒于Th17 及Treg 在COPD中的作用及DC-SOCS1 對(duì)T 細(xì)胞的影響，因此，本研究擬通過(guò)DC-SOCS1 干預(yù)COPD 模型小鼠，闡明肺組織中IL-17，IL-23，IL-10 和TGF-β 變化，希望為COPD 的防治提供新思路及策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及和主要試劑C57BL/6 小鼠，6 ～8 周，80 只［第三軍醫(yī)大學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，小鼠許可證號(hào)：SCXK（渝）2017-0001］。胎牛血清（FBS）、RPMI 1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司），小鼠白細(xì)胞介素-17（IL-17）、白細(xì)胞介素-23（IL-23）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）ELISA kit（北京麗科創(chuàng)欣生物科技有限公司），GMCSF、IL-4（PEPROTECH 公司），一抗為兔來(lái)源的SOCS1（Abcam 公司），二抗為羊抗兔IgG（sigma 公司），質(zhì)粒小量抽提試劑盒（Promega 公司），DH5α感受態(tài)（TaKaRa 公司）。

1.2 小鼠骨髓源性DCs的提取及培養(yǎng)處死小鼠，分離去除股骨和脛骨的骨骺端，用PBS對(duì)骨髓沖洗，用離心機(jī)1 000 r/min 離心5 min，丟棄上清液體，再次用PBS 混勻底部細(xì)胞沉淀，用混勻的細(xì)胞液同淋巴細(xì)胞分離液一起離心（2 000 r/min 20 min），抽出骨髓基質(zhì)細(xì)胞層部分，PBS 洗3 次。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行接種培養(yǎng)并于第7天加LPS（100 ng/μL）誘導(dǎo)成熟。

1.3 掃描電鏡觀察LPS 誘導(dǎo)成熟的DCs對(duì)鋪片培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行PBS 漂洗，先后用戊二醛、鋨酸4 ℃固定，以醋酸異戊酯脫水、取樣。真空噴鍍法對(duì)樣品進(jìn)行導(dǎo)電處理，鏡下觀察。

1.4 SOCS1 慢病毒及空載慢病毒的構(gòu)建及感染骨髓源性imDCs原代分離培養(yǎng)DC，第5 天行慢病毒感染。取出4 ℃保存的病毒，離心20 s。據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)MOI=100 進(jìn)行試驗(yàn)，慢病毒用量=MOI×細(xì)胞數(shù)目/慢病毒滴度，吸取病毒液加入細(xì)胞，并加5 μg/mL 的Polybrene 助轉(zhuǎn)染劑?；靹蚝髮?4 孔板放在37 ℃度培養(yǎng)箱中孵育。24 h 更換培養(yǎng)基。感染4 h 后，熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)。

1.5 Western blot 分析DC-SOCS1 表達(dá)效果BCA法蛋白定量按照1：50 比例稀釋樣品液，加BCA工作液，37 ℃孵箱孵育30 min，酶標(biāo)儀在562 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定待測(cè)樣品液濃度，蛋白變性后-20 ℃保存。SDS-PAGE 電泳：配膠及灌膠、上樣、轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗過(guò)夜（內(nèi)參一抗稀釋濃度1∶1 000，DC-SOCS1 一抗稀釋濃度1∶500）。孵育二抗1.5 h（1∶1 000）清洗，顯色。

1.6 COPD 造模及DCs 回輸48 只雄性6 ～8 周齡體質(zhì)量20 ～25 g 的C57BL/6 小鼠予以隨機(jī)分組，每組各6 只共8 組。A：正常空氣對(duì)照組；B：生理鹽水回輸組（煙熏第1 天）；C：早期低劑量DCSOCS1 回輸組（煙熏第1 天）；D：早期高劑量DCSOCS1 回輸組（煙熏第1 天）；E：imDCs 1×106回輸組（煙熏第1 天）；F：低劑量DC-SOCS1 回輸組（煙熏第7 天）；G：高劑量DC-SOCS1 回輸組（煙熏第7 天）；H：imDCs 1×106回輸組（煙熏第7 天），以上回輸均以0.1 mL/10 g 進(jìn)行回輸。置于12 ～12 h 晝夜交替動(dòng)物房，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（低劑量：1 × 106高劑量：2 × 106）。以28 d 煙熏法COPD 模型小鼠［10］制模型，將小鼠放在自制的煙熏箱（45 cm × 30 cm × 30 cm）中，使它們?nèi)藶楸粍?dòng)地吸煙，每次3 支，每次1 h，每天4 次，每周7 d，煙熏28 d。對(duì)照組則于空氣中正常飼養(yǎng)。余7 組進(jìn)行上述差異化處理。

1.7 肺組織標(biāo)本的處理及HE 染色建模28 d 后，通過(guò)腹腔注射7%的水合氯醛（5 mL/kg）麻醉小鼠，用冰PBS 洗凈獲取的新鮮肺組織，左上葉肺組織用于HE 染色：切片烘烤、脫臘、染色、封片、鏡檢。

1.8 ELISA 測(cè)肺組織中IL-17、IL-23、IL-10 和TGF-β收集肺組織勻漿上清液，ELISA 檢測(cè)肺組織中IL-17、IL-23、IL-10 和TGF-β的水平做標(biāo)準(zhǔn)曲線（IL-17、IL-23：240、160、80、40、20 μg/mL；IL-10：600、400、200、100、50 μg/mL；TGF-β：180、120、60、30、15 μg/mL）、加入待測(cè)樣品、溫育、洗滌、酶標(biāo)試劑、洗滌、顯示、終止、450 nm 波長(zhǎng)測(cè)OD值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用GraphPad Prism 6、SPSS 18.0 分析所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。運(yùn)用Kolmogorov-Smirnov 方法檢驗(yàn)計(jì)量資料的分布正態(tài)性。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)的計(jì)量資料都符合正態(tài)分布，用表示，多組間的比較使用單因素方差分析。以析因設(shè)計(jì)資料的方差分析實(shí)驗(yàn)中回輸細(xì)胞類型及回輸時(shí)間對(duì)細(xì)胞因子的作用。以LSD-t、Dunnett-t檢驗(yàn)均數(shù)間多重比較。P＜0.05 表示差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)及鑒定小鼠骨髓源性DCs從小鼠股骨及脛骨中沖洗提取骨髓源性DCs。于含GM-CSF、IL-4 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)前體細(xì)胞向imDCs 分化，于第7 天加LPS 成熟刺激24 h，用掃描電鏡觀察，鏡下見樹枝狀突起不規(guī)則的典型DCs 形態(tài)特征（圖1）。這表明骨髓源性DCs 的成功提取、培養(yǎng)及鑒定，且經(jīng)LPS 刺激后能正常成熟。

圖1 掃描電鏡：LPS 誘導(dǎo)成熟的DCsFig.1 Scanning electron microscope：LPS-induced mature DCs

2.2 構(gòu)建DC-SOCS1 模型熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)，圖2中綠色熒光表示載有過(guò)表達(dá)SOCS1 的imDCs 及空轉(zhuǎn)慢病毒的imDCs。

使用WB 測(cè)定SOCS1 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：SOCS1 在DC-SOCS1 中的表達(dá)（43.77 ± 3.73）較DCs-Lv-GFP（17.29 ± 4.47）和imDCs 組（18.88 ±3.22）明顯增加，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見圖3）。

圖2 過(guò)表達(dá)SOCS1 的imDCs 及空轉(zhuǎn)慢病毒的imDCs（×100）Fig.2 Lentiviral transfection into bone marrow-derived imDCs（×100）

圖3 Western blot 測(cè)DC-SOCS1 中SOCS1 表達(dá)水平Fig.3 Expression level of SOCS1 in DC-SOCS1 detected by Western blot

2.3 煙熏28 d 后小鼠肺組織病理變化特征本研究采用28 d 煙熏法構(gòu)建COPD 模型，將空氣對(duì)照組和回輸生理鹽水組肺組織進(jìn)行HE 染色。如圖4A示，空氣對(duì)照組小鼠肺組織的肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整，無(wú)斷裂、融合，其間僅見少許浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞。COPD 煙熏模型組（圖4B）肺組織中可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞，斷裂，相鄰肺泡腔相互融合擴(kuò)大，構(gòu)成典型肺氣腫征象，此煙熏小鼠模型具有COPD 典型的病理學(xué)特征，包括肺實(shí)質(zhì)炎癥和肺氣腫。

圖4 COPD 小鼠模型肺組織的HE 染色（×400）Fig.4 HE staining of lung tissue in COPD mice（×400）

2.4 過(guò)表達(dá)SOCS1的DCs干預(yù)COPD小鼠后肺組織Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17及IL-23表達(dá)減少煙熏第1 天回輸后，小鼠肺組織IL-17 及IL-23 表達(dá)水平在生理鹽水組、imDCs 組、低劑量DC-SOCS1 組（1 × 106）和高劑量DC-SOCS1 組（2 × 106）間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。和生理鹽水組比，IL-17 及IL-23 在肺組織的表達(dá)水平在其他三組均顯著降低。析因設(shè)計(jì)方差分析顯示，各組小鼠肺組織中IL-17 及IL-23 的表達(dá)水平存在差異。DC-SOCS1 組 和imDCs 組 比，IL-17 及IL-23 表 達(dá)水平降低（P＜0.05），且DC-SOCS1（2 × 106）組較DC-SOCS1（1 × 106）組降低更顯著（P＜0.05）；煙熏早期（第1 天）較第7 天降低（P＜0.05）；此外，煙熏后不同回輸?shù)姆纸M和時(shí)間共同起作用，本研究發(fā)現(xiàn)IL-17、IL-23 最低水平時(shí)是發(fā)生在回輸DC-SOCS1（2×106）第1 天后。見表1、2。

表1 IL-17 在COPD 小鼠肺組織中的表達(dá)（n=6）Tab.1 Expression of IL-17 in lung tissue of COPD mice±s

表1 IL-17 在COPD 小鼠肺組織中的表達(dá)（n=6）Tab.1 Expression of IL-17 in lung tissue of COPD mice±s

注：與NS 組比較，*P ＜0.05 ；與同imDCs 組比較，☆P ＜0.05 ；與同DC-SOCS11 組比較，▲P ＜0.05；DC-SOCS11 代表1× 106 DCSOCS1；DC-SOCS12代表2×106 DC-SOCS1

第7 天NS imDCs DC-SOCS11 DC-SOCS12第1 天52.24±1.00 28.11±0.97*13.05±0.55*☆6.49±0.49*☆▲37.59±0.35*16.13±0.69*☆8.49±0.17*☆▲

表2 COPD 小鼠模型肺組織中IL-23 的表達(dá)（n=6）Tab.2 Expression of IL-23 in lung tissue of COPD mice±s

表2 COPD 小鼠模型肺組織中IL-23 的表達(dá)（n=6）Tab.2 Expression of IL-23 in lung tissue of COPD mice±s

注：與NS 組比較，*P ＜0.05 ；與imDCs 組比較，☆P ＜0.05 ；與同DC-SOCS11 組 比 較，▲P ＜0.05；DC-SOCS11 代 表1× 106 DCSOCS1；DC-SOCS12代表2×106 DC-SOCS1

第7 天NS imDCs DC-SOCS11 DC-SOCS12第1 天224.1±1.1 176.3±4.4*139.9±1.4*☆92.2±2.2*☆▲195.4±0.9*152.3±1.1*☆126.3±1.1*☆▲

2.5 過(guò)表達(dá)SOCS1的DCs干預(yù)COPD小鼠后肺組織Treg 相關(guān)細(xì)胞因子IL-10 及TGF-β表達(dá)增加煙熏第1 天回輸后，小鼠肺組織IL-10 及TGF-β表達(dá)水平在生理鹽水組、imDCs 組、低劑量DC-SOCS1組（1×106）和高劑量DC-SOCS1 組（2×106）間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。和生理鹽水組比，余三組中IL-10 和TGF-β在小鼠肺組織中均顯著增加。析因設(shè)計(jì)方差分析示，各組小鼠肺組織IL-10及TGF-β存在差異。DC-SOCS1 組IL-10 和TGF-β的表達(dá)水平較imDCs 組增加（P＜0.05），且高劑量DC-SOCS1（2 × 106）組較低劑量DC-SOCS1（1 ×106）組IL-10 及TGF-β水平增加更明顯（P＜0.05）；煙熏早期（第1 天）較第7 天增加（P＜0.05）。其中，TGF-β在煙熏后不同回輸?shù)姆纸M和時(shí)間共同起作用，即第1 天回輸DC-SOCS1（2 × 106）后水平最高，而對(duì)于IL-10 不存在交互作用。見表3、4。

表3 IL-10 在COPD 小鼠肺組織中的表達(dá)（n=6）Tab.3 Expression of IL-10 in lung tissue of COPD mice±s

表3 IL-10 在COPD 小鼠肺組織中的表達(dá)（n=6）Tab.3 Expression of IL-10 in lung tissue of COPD mice±s

注：與NS 組比較，*P ＜0.05 ；與同imDCs 組比較，☆P ＜0.05 ；與同DC-SOCS11 組比較，▲P ＜0.05；DC-SOCS11 代表1× 106 DCSOCS1；DC-SOCS12代表2×106 DC-SOCS1

第7 天NS imDCs DC-SOCS11 DC-SOCS12第1 天35.05±2.01 43.56±1.95*54.08±1.78*☆71.64±1.57*☆▲40.00±2.35*48.18±1.52*☆66.53±4.91*☆▲

表4 COPD 小鼠模型肺組織中TGF-β 的表達(dá)（n=6）Tab.4 Expression of TGF-β in lung tissues of COPD mice±s

表4 COPD 小鼠模型肺組織中TGF-β 的表達(dá)（n=6）Tab.4 Expression of TGF-β in lung tissues of COPD mice±s

注：與NS 組比較，*P ＜0.05 ；與同imDCs 組比較，☆P ＜0.05 ；與同DC-SOCS11 組比較，▲P ＜0.05；DC-SOCS11 代表1× 106 DCSOCS1；DC-SOCS12代表2×106 DC-SOCS1

NS imDCs DC-SOCS11 DC-SOCS12第1 天23.49±0.43 32.81±0.46*40.54±0.48*☆48.90±0.41*☆▲第7 天-30.87±0.62*38.44±0.42*☆42.23±0.38*☆▲

3 討論

Th17 具強(qiáng)烈的促炎活性，可招募巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，產(chǎn)生IL-17 放大炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎性疾病的發(fā)展，也可通過(guò)IL-23 促進(jìn)自身分泌IL-17，維持及放大其功能，在許多炎癥及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用［11］。研究發(fā)現(xiàn)Th17 相關(guān)細(xì)胞因子在COPD 模型中是增加的，且與疾病的嚴(yán)重程度及FEV1%呈正相關(guān)［12］。本實(shí)驗(yàn)用DC-SOCS1 及imDC 對(duì)COPD 小鼠進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)ELISA 測(cè)Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17 及IL-23 的變化。與對(duì)照組比，imDCs、低劑量DC-SOCS1（1 × 106）和高劑量DC-SOCS1（2 × 106）回輸后均能減少COPD 小鼠肺組織IL-17 和IL-23 的表達(dá)，其中DC-SOCS1 效果顯著，且在本實(shí)驗(yàn)中與濃度及時(shí)間有關(guān)。鑒于Th17及其相關(guān)細(xì)胞因子在COPD 中的促炎作用，推測(cè)DC-SOCS1 干預(yù)后可能通過(guò)減少Th17 相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，減輕COPD 的肺部炎癥反應(yīng)，從而減輕或延緩COPD 的病情進(jìn)展。當(dāng)然，這有待本課題組進(jìn)一步的肺組織病理結(jié)果證實(shí)。

Treg 通過(guò)細(xì)胞間的直接接觸或間接分泌細(xì)胞因子，主要是IL-10 和TGF-β等抑制T 細(xì)胞的增殖分化，從而在免疫耐受及機(jī)體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。有報(bào)道示免疫微環(huán)境改變刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生，引起Th17/Treg 的失衡并參與COPD 的發(fā)生發(fā)展，且Treg 及其細(xì)胞因子IL-10 和TGF-β是減少的［13］。在本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)DC-SOCS1 或imDC 干預(yù)后IL-10 及TGF-β表達(dá)增加，且DC-SOCS1效果較imDC顯著，并與時(shí)間及濃度有關(guān)。推測(cè)其可能通過(guò)增加Treg 相關(guān)細(xì)胞因子IL-10 及TGF-β的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的抗炎或誘導(dǎo)免疫耐受的能力，延緩COPD 的病情。

研究發(fā)現(xiàn)原花青素減輕支氣管哮喘的氣道炎癥是通過(guò)抑制imDC 的成熟及誘導(dǎo)免疫耐受實(shí)現(xiàn)［14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DC-SOCS1 的干預(yù)效果均優(yōu)于imDC，結(jié)合抗原刺激DC 成熟及SOCS1 對(duì)imDC抑制成熟作用，推測(cè)可能是imDC 回輸入體后經(jīng)體內(nèi)抗原等刺激，逐漸成熟，其誘導(dǎo)免疫耐受的能力減弱或消失，而過(guò)表達(dá)SOCS1 能持續(xù)抑制imDC 成熟，使DC-SOCS1 傾向于imDC 從而誘導(dǎo)免疫耐受所致。此外，本實(shí)驗(yàn)中亦發(fā)現(xiàn)，DC-SOCS1 的干預(yù)效果可能與濃度及時(shí)間有關(guān)，即早期高濃度對(duì)Th17及Treg 相關(guān)細(xì)胞因子的影響更明顯，推測(cè)其可能原因?yàn)楦邼舛认略皆绺深A(yù)，越能及時(shí)抑制imDC 的成熟并較好地誘導(dǎo)免疫耐受所致。

DC-SOCS1 對(duì)T 細(xì)胞增殖分化及功能的影響，在腫瘤、移植物抗宿主病及自身免疫性疾病中已被廣泛研究，但在COPD 中尚未報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以DC-SOCS1 干 預(yù)COPD 小 鼠 模 型，發(fā) 現(xiàn)COPD 小 鼠肺組織中Th17 相關(guān)細(xì)胞因子IL17 及IL-23 是減少的，而Treg 相關(guān)細(xì)胞因子IL-10 及TGF-β是增加的，可能為COPD 的干細(xì)胞防治提供新思路。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)有局限性，如僅從細(xì)胞因子層面反映了DC-SOCS1 對(duì)COPD 小鼠的影響，缺乏各組肺組織病理改變予以證實(shí)，且缺乏其具體的作用機(jī)制，這也是本課題組正在進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，以期找到延緩或改善COPD 病情的新策略。