唐素婷 區(qū)錫敏 黃桂東 程云輝 蔡逸夫 楊曉萍 銀 波 張 燦 鐘先鋒

(1. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231；2. 廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程 技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；3. 廣東省食品流通安全控制工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；4. 佛山農(nóng)業(yè)生物制造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；5. 長沙理工大學(xué) 化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南 長沙 410114；6. 開平市佰益飼料科技發(fā)展有限公司，廣東 江門 529300)

醬油渣是醬油發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)淋油或抽油產(chǎn)生的固體殘?jiān)黐1]。2017年中國醬油產(chǎn)量接近860萬t[2]，按照每生產(chǎn)1 kg醬油產(chǎn)出0.67 kg醬油渣比例進(jìn)行計(jì)算，中國醬油渣年產(chǎn)量高達(dá)600萬t。醬油渣富含粗蛋白[3]、粗脂肪[4]等物質(zhì)，是理想的非常規(guī)蛋白飼料[5]。但醬油渣用作飼料，存在含鹽量較高、適口性較差及不易貯存等缺點(diǎn)[6-7]，在一定程度上限制了醬油渣的應(yīng)用。接種特定微生物，再次發(fā)酵醬油渣，改善其理化性質(zhì)及營養(yǎng)品質(zhì)，可解決上述問題[8-9]。

醬油發(fā)酵是一個多種微生物參與的過程，乳酸菌是其發(fā)酵過程中的主要細(xì)菌。不同發(fā)酵階段醬醪中乳酸菌群的組成不同，主要包括嗜鹽四聯(lián)球菌屬[10-11]、乳桿菌屬、乳酸乳球菌、片球菌屬、魏斯氏菌屬等[12-13]。乳桿菌是目前應(yīng)用最多的益生菌，其中干酪乳桿菌及植物乳桿菌被公認(rèn)為是最經(jīng)典的益生菌[14]。近年來，從干酪乳桿菌中劃分出來的副干酪乳桿菌受到較多關(guān)注。Jahreis等[15]研究發(fā)現(xiàn)， LTH2579能顯著提高機(jī)體粒細(xì)胞吞噬率及氧化型低密度脂蛋白抗體水平；田丹[16]研究發(fā)現(xiàn)，X12產(chǎn)生的肽聚糖具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫原性死亡的功能；Gardiner等[17]研究表明，副干酪乳桿菌發(fā)酵干酪，可增加干酪產(chǎn)品中游離氨基酸的數(shù)量，提高產(chǎn)品質(zhì)量。目前對于醬油發(fā)酵過程乳酸菌資源的研究中，尚未見醬油渣中副干酪乳桿菌的相關(guān)研究報道。

試驗(yàn)擬采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法從醬油渣中分離、純化乳桿菌，利用生理生化特征試驗(yàn)及分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，并測定其對模擬人工胃液、腸液的耐受性，疏水性與抗氧化性能，以期篩選得到益生特性良好的副干酪乳桿菌，為其再次應(yīng)用于醬油渣發(fā)酵或飼料生產(chǎn)等方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

醬油渣：原料主要為大豆與小麥粉，采用高鹽稀態(tài)工藝釀造，廣東省某調(diào)味食品有限公司；

革蘭氏染色試劑盒、過氧化氫生化鑒定管、吲哚生化鑒定管、硫化氫生化鑒定管、明膠生化鑒定管、硝酸鹽(還原)生化鑒定管、MRS肉湯等：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

全自動滅菌鍋：GR60DA型，致微(廈門)儀器有限公司；

顯微鏡：PH100型，鳳凰光學(xué)集團(tuán)有限公司；

電子分析天平：ME104型，梅特勒—托利多精密儀器公司；

防凍霜冰箱：BCD-189WDPV型，海爾股份有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：LRH-150型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

微孔板分光光度計(jì)酶標(biāo)儀：Epoch2型，美國伯騰儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 醬油渣中乳酸菌的分離純化 根據(jù)文獻(xiàn)[18-20]修改如下：無菌條件下，稱取醬油渣25 g溶解于225 g無菌磷酸鹽緩沖溶液中，制成10-1，10-2，…，10-7共7個濃度稀釋液。吸取稀釋液0.1 mL，涂布于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h。挑取菌落反復(fù)劃線至菌落一致。挑取單菌落于MRS肉湯中37 ℃培養(yǎng)12 h，與體積分?jǐn)?shù)50%甘油按1∶1(體積比)混合，-20 ℃保藏備用。劃線于MRS固體斜面培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至長出菌落，4 ℃保藏備用。

1.2.2 醬油渣中乳酸菌的鑒定

(1) 形態(tài)學(xué)觀察：根據(jù)文獻(xiàn)[21]修改如下，菌株劃線于固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌株的菌落形態(tài)。進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)，顯微鏡下觀察菌株的菌體形態(tài)。革蘭氏陽性菌株進(jìn)行過氧化氫酶接觸試驗(yàn)，有氣泡產(chǎn)生為陽性反應(yīng)，無氣泡產(chǎn)生為陰性。

(2) 生理生化試驗(yàn)：參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[22]，具體試驗(yàn)操作參考生化鑒定管的說明書。

(3) 分子生物學(xué)鑒定：將革蘭氏呈陽性、過氧化氫酶接觸試驗(yàn)呈陰性菌株送至華大基因進(jìn)行16S rRNA基因序列測序。

(4) 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：根據(jù)文獻(xiàn)[23-24]進(jìn)行修改，根據(jù)菌株的測序序列信息，登陸GenBank中BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)比對，在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫查詢模式菌株信息，利用Mega 5.0軟件，采用鄰近算法，bootstrap為1 000構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 副干酪乳桿菌模擬胃液耐受性測定 根據(jù)文獻(xiàn)[25]修改如下：菌株活化3代，調(diào)節(jié)菌液OD600 nm=1.00±0.05，吸取3 mL菌液，4 000 r/min離心10 min，去上清液，將菌體懸浮于3 mL滅菌生理鹽水制成菌懸浮液。無菌離心管中加入人工胃液9 mL、菌懸浮液1 mL，混合均勻。37 ℃培養(yǎng)，分別在0(稀釋度為10-4，10-5，10-6)，3 h(稀釋度為10-3，10-4，10-5)取樣0.1 mL，使用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌株存活率。設(shè)置3個平行，按式(1)計(jì)算菌株存活率。

(1)

式中：

S1——菌株存活率，%；

A0——耐受人工胃液0 h的活菌數(shù)，CFU/mL；

A1——耐受人工胃液3 h的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.4 副干酪乳桿菌模擬腸液耐受性測定 根據(jù)文獻(xiàn)[25]修改如下：取人工胃液消化3 h的菌株培養(yǎng)液1 mL，接種于9 mL人工腸液中，37 ℃培養(yǎng)0(稀釋度10-3，10-4，10-5)，4(稀釋度10-2，10-3，10-4)，8 h(稀釋度10-2，10-3，10-4)，使用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌株存活率。設(shè)置3個平行，按式(2)計(jì)算菌株存活率。

(2)

式中：

S2——菌株存活率，%；

A0——人工腸液耐受0 h的活菌數(shù)，CFU/mL；

As——人工腸液耐受4，8 h的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.5 副干酪乳桿菌表面疏水性測定 根據(jù)文獻(xiàn)[25]修改如下：菌株活化3代，調(diào)節(jié)菌液OD600 nm=1.00±0.05，接種量為2%(體積分?jǐn)?shù))，37 ℃培養(yǎng)12 h。菌液5 000 r/min 離心5 min，磷酸鹽溶液洗滌2～3次，重懸。測定菌株OD600 nm。吸取上述菌懸浮液3 mL，加入二甲苯1 mL，室溫培養(yǎng)15 min，震蕩使其混合，室溫靜置1 h，吸取下層水相，以磷酸鹽緩沖液為空白對照，測定OD600 nm，按式(3)計(jì)算菌株疏水率。

(3)

式中：

S3——菌株疏水率，%；

A0——菌液與二甲苯混勻前菌液的OD600 nm值；

A——菌液與二甲苯混勻后菌液的OD600 nm值。

1.2.6 副干酪乳桿菌抗氧化能力測定

(1) 副干酪乳桿菌培養(yǎng)及無細(xì)胞提取物的制備：根據(jù)文獻(xiàn)[26-27]修改如下，挑取人工胃腸液耐受性及疏水性良好的菌株進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)。菌株活化3代，接種量2%(體積分?jǐn)?shù))，37 ℃培養(yǎng)1 d。4 ℃下4 000 r/min離心20 min，去上清收菌體。用磷酸鹽緩沖液洗滌菌體3次，重懸，調(diào)整OD600 nm=1.00±0.05。菌懸液分為制備乳酸菌無細(xì)胞提取物(CFE)和菌體細(xì)胞(IC)兩組。菌懸液冰浴下超聲破碎12 min，每工作9 s，停歇12 s，4 ℃下9 500 r/min 離心15 min，上清液即為無細(xì)胞提取物。將菌體細(xì)胞和無細(xì)胞提取物于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2) 副干酪乳桿菌清除DPPH能力測定：根據(jù)文獻(xiàn)[26]修改如下，分別取2 mL菌體懸浮液(無細(xì)胞提取物)、DPPH溶液(0.2 mmol/L)，室溫下避光反應(yīng)0.5 h，測定OD517 nm，空白為無水乙醇。按式(4)計(jì)算菌株DPPH清除率。

(4)

式中：

S4——菌株DPPH清除率，%；

Ai——2 mL DPPH+2 mL樣品的OD517 nm；

Aj——2 mL無水乙醇+2 mL樣品的OD517 nm；

A0——2 mL DPPH+2 mL無水乙醇的OD517 nm。

(3) 副干酪乳桿菌清除羥基自由基能力測定：根據(jù)文獻(xiàn)[26]修改如下，分別取2 mL鄰菲啰啉(2.5 mmol/L)、磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4，0.02 mol/L)、蒸餾水，混勻。分別加入2 mL硫酸亞鐵溶液(2.5 mmol/L)、H2O2(20 mmol/L)溶液，混勻，37 ℃水浴90 min。4 ℃下5 000 r/min 離心6 min，測定OD536 nm，空白為磷酸鹽緩沖溶液。按式(5)計(jì)算羥基自由基清除率。

(5)

式中：

S5——羥基自由基清除率，%；

Ai——2 mL蒸餾水代替2 mL H2O2的OD536 nm；

Aj——用2 mL細(xì)胞懸浮液或無細(xì)胞提取物代替2 mL 蒸餾水的OD536 nm；

A0——磷酸鹽緩沖溶液的OD536 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理采用Excel 2013以及SPSS 17.0，采用Origin 9繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的菌落形態(tài)

從醬油渣中分離得到10株乳酸菌，分別為菌株HT31、HT51、HT90、HT111、HT125、HT155、HT158、HT159、HT253及HT256，菌落顏色均為奶白色，中央凸起，菌落表面光滑有光澤，邊緣齊整，直徑為0.5～1.5 mm，菌落形態(tài)如圖1所示。經(jīng)革蘭氏染色試驗(yàn)及酶觸試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10株乳酸菌的菌體形態(tài)均為桿狀，酶觸試驗(yàn)均呈陰性，菌體形態(tài)如圖2所示。

圖1 乳酸菌在MRS固體培養(yǎng)基的菌落形態(tài)

2.2 乳酸菌生理生化試驗(yàn)特征

由表1可知，菌株HT31、HT51、HT90、HT111、HT125、HT155、HT158、HT159、HT253和HT256在酶觸、硝酸鹽還原、明膠液化、H2S產(chǎn)生、吲哚試驗(yàn)中均呈陰性，參考張剛[28]、華鶴良[29]的方法，結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果，初步判定上述菌株為乳桿屬(Lactobacillus)。

圖2 部分乳酸菌菌株的菌體形態(tài)

表1 醬油渣中乳酸菌的生理生化鑒定結(jié)果?

? “+”表示反應(yīng)呈陽性；“-”表示反應(yīng)呈陰性、不生長或生長不明顯。

2.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

對10株乳酸菌進(jìn)行基因組提取、PCR擴(kuò)增及測序。凝膠電泳圖如圖3所示。由圖3可知，10株乳酸菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小均在1 500 bp左右，且電泳帶光亮明顯，無雜質(zhì)，可進(jìn)行測序[30]。

得到菌株16S rRNA基因序列后，進(jìn)行Blast比對，結(jié)果如表2所示。使用Mega 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4 所示。由圖4可知，菌株HT31、HT51、HT90、HT111、HT125、HT155、HT158、HT159、HT253、HT256均與模式菌株Lactobacillusparacaseisubsp.paracaseiATCC 25302T、Lactobacillusparacaseisubsp.toleransJCM 1171T處于同一分支。結(jié)合表2，將菌株HT31、HT51、HT90、HT111、HT125、HT159、HT253、HT256鑒定為Lactobacillusparacaseisubsp.paracasei(副干酪乳桿菌副干酪亞種)；將菌株HT155、HT158鑒定為Lactobacillusparacaseisubsp.tolerans(副干酪乳桿菌堅(jiān)韌亞種)。Wei等[31]發(fā)現(xiàn)參與醬油發(fā)酵的細(xì)菌主要有乳桿菌、魏斯氏菌、芽孢桿菌等；胡傳旺[12]研究發(fā)現(xiàn)，醬油發(fā)酵過程的主要微生物有乳桿菌、片球菌、魏斯氏菌等。

電泳條件：3 μL樣品+1%瓊脂糖凝膠，使用Trans 2K@Plus DNA Marker

圖3 部分乳酸菌16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure 3 Electrophoresis of 16S rRNA amplified products of partial lactic acid bacteria

表2 醬油渣中分離菌株的16S rRNA序列同源性比對結(jié)果

0.02表示2%的堿基替換率

2.4 副干酪乳桿菌模擬胃液耐受能力

在實(shí)際應(yīng)用中，乳酸菌要發(fā)揮其積極作用會受到諸多因素的限制，其中包括機(jī)體消化道中低pH胃液的作用[32]。如乳酸菌耐受胃液的能力差，則導(dǎo)致菌株存活率過低，難以發(fā)揮其益生特性，因此胃液耐受能力是研究乳酸菌益生特性的指標(biāo)之一。由圖5可知，菌株HT31、HT256對模擬胃液耐受性較好，在胃液中耐受3 h后，菌株存活率分別為(86.33±1.24)%，(80.88±5.39)%；菌株HT90、HT158、HT159、HT253耐受胃液3 h后，菌株存活率分別為(66.32±0.35)%，(69.08±0.41)%，(67.15±0.03)%，(63.47±0.67)%；菌株HT155、HT51、HT111耐受胃液3 h后，菌株存活率分別為(57.43±1.56)%，(48.66±0.28)%，(31.37±0.50)%；菌株HT125的存活率較低，僅為(13.45±0.11)%。

圖5 副干酪乳桿菌在模擬人工胃液中的存活率

Figure 5 The experimental results ofLactobacillusparacaseiin simulated artificial gastric juice

2.5 副干酪乳桿菌模擬腸液耐受能力

乳酸菌耐受機(jī)體腸道高膽汁酸的能力是研究其益生特性的又一指標(biāo)[32]。由圖6可知，菌株HT31、HT253、HT111、HT155耐受腸液能力較好，耐受腸液4 h后的存活率分別為(95.40±0.55)%，(85.36±0.02)%，(74.56±0.44)%，(71.57±0.15)%；其余菌株耐受腸液4 h后的存活率均在30%～60%。耐受模擬腸液8 h后，菌株HT31、HT111、HT155的耐受能力較好，存活率分別為(60.22±0.16)%，(62.18±0.70)%，(52.84±0.00)%；菌株HT51、HT90、HT158耐受模擬腸液能力稍差，存活率分別為(39.04±1.03)%，(36.00±0.04)%，(43.67±0.09)%；菌株HT125、HT159、HT253、HT256耐受模擬腸液8 h后，存活率<30%。

2.6 副干酪乳桿菌表面疏水性

乳酸菌進(jìn)入人體腸道后，需要有一定的腸道附著能力才能發(fā)揮其益生特性。細(xì)菌的疏水性有利于細(xì)菌對腸膜的黏附，疏水性越大，細(xì)菌黏附力越大[33]。由圖7可知，菌株HT111、HT155疏水性較好，疏水率分別為(26.51±0.66)%，(25.41±0.58)%；菌株HT31、HT256、HT253的疏水性稍弱，疏水率分別為(18.52±0.76)%，(17.59±0.24)%，(15.77±0.49)%；其余菌株的疏水率<10%。

圖6 副干酪乳桿菌在模擬人工腸液中的存活率

Figure 6 Experiments on the number of living bacteria ofLactobacillusparacaseiin simulated artificial intestinal fluid

圖7 副干酪乳桿菌的表面疏水率

2.7 副干酪乳桿菌抗氧化能力

挑選模擬胃液、腸液耐受性良好，疏水性較好的副干酪乳桿菌菌株HT31、HT111、HT155進(jìn)行抗氧化能力測定。由圖8可知，菌株HT31清除DPPH的能力較好，其細(xì)胞懸浮液的DPPH·清除率為(26.25±0.01)%，無細(xì)胞提取物的清除率為(16.03±0.03)%；菌株HT111、HT155細(xì)胞懸浮液的DPPH·清除率<10%，其無細(xì)胞提取物的DPPH·清除率分別為(15.03±0.02)%，(18.67±0.09)%。由圖9可知，菌株HT31、HT155清除·OH能力較好，其細(xì)胞懸浮液清除率分別為(42.88±0.21)%，(36.10±0.00)%，其無細(xì)胞提取物·OH清除率分別為(27.74±0.01)%，(38.24±0.73)%；菌株HT111的細(xì)胞懸浮液、無細(xì)胞提取物·OH清除率分別為(33.33±0.00)%，(28.24±0.06)%。綜上，菌株HT31抗氧化能力最佳。

圖8 副干酪乳桿菌清除DPPH·的能力

圖9 副干酪乳桿菌清除·OH的能力

3 結(jié)論

從醬油渣中分離得到10株乳酸菌，經(jīng)鑒定，8株屬于Lactobacillusparacaseisubsp.paracasei，2株屬于Lactobacillusparacaseisubsp.tolerans；對10株菌株進(jìn)行模擬胃腸液耐受性、疏水性及抗氧化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株HT31的耐受模擬胃腸環(huán)境能力、疏水能力以及抗氧化能力較強(qiáng)。菌株HT31豐富了乳酸菌資源庫，后續(xù)可研究菌株HT31的益生特性及應(yīng)用性能，為醬油渣的深入開發(fā)及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。