黃柳娟 邵 毅,2 馮 博 周昌艷,2

(1. 上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質量標準與檢測技術研究所，上海 201403； 2. 上海市設施園藝技術重點實驗室，上海 201403)

抗生素耐藥細菌(antibiotic resistant bacteria，ART bacteria)在醫(yī)療和農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖中的快速增多對人類公共衛(wèi)生安全造成巨大威脅[1]，ART致病菌在醫(yī)院的接觸轉移及控制策略方面得到了深入研究[2]，手衛(wèi)生成為控制院感多重ART菌的重要手段[3-4]。在農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖和肉品加工領域，動物源性ART菌可能通過食物鏈[5]或在養(yǎng)殖、加工和消費各環(huán)節(jié)[6]向人類擴散，預示耐藥風險同樣存在于并未濫用抗生素的普通民眾中。研究人員[7]從食品加工者的手上分離到了多重耐藥的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，但除此以外，動物源ART菌向食品從業(yè)人員或消費者手部遷移的研究還未展開。相對于致病菌，普通細菌數(shù)量眾多，且包含的耐藥基因(antibiotic resistance genes，AR genes)和遷移元件更為多樣，不同種屬細菌的耐藥程度[8]和耐藥性遷移潛勢[9-11]差異巨大，因此肉品加工者手部ART菌菌群組成的揭示，是評估其耐藥性暴露風險的基礎之一。

目前，在養(yǎng)雞場和生鮮雞肉產(chǎn)品表面已發(fā)現(xiàn)了大量的四環(huán)素耐藥菌和磺胺耐藥菌，且存在AR基因在不同菌種間遷移的潛勢[12-15]。研究模擬冷鮮雞生產(chǎn)加工和消費初加工中操作人員徒手接觸雞肉的過程，以四環(huán)素類耐藥菌和磺胺耐藥菌為例，擬通過選擇性培養(yǎng)和IonS5TMXL測序平臺分析手部ART菌的菌落結構，為進一步揭示雞肉加工操作人員的抗生素耐藥暴露風險提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

冷鮮雞肉產(chǎn)品：科寶500或浦東雞，上海大型超市和生鮮超市。隨機選取上海市6個大型超市和生鮮超市，每個超市購買1份冷鮮雞樣品(2份雞翅中，2份雞大胸，2份雞腿，每類包括散裝和預包裝樣品各1份，共6份，分別編號為A～F)。樣品用無菌袋盛裝，采樣時避免外源污染微生物，在冰盒(約4 ℃)中于3 h內運回實驗室，用于徒手接觸雞肉的模擬試驗；

腦心浸液肉湯(Brain heart infusion broth, BHI)瓊脂培養(yǎng)基：英國OXOID公司；

四環(huán)素(Tetracycline，TET)、磺胺甲惡唑(Sulfamethoxazole，SUL)和甲氧芐啶(Trimethoprim，TRI)：分析純，美國SIGMA公司；

真菌抑制劑放線菌酮(Cycloheximide，CYC)：分析純，美國AMRESCO公司；

Swab涂抹棒：3M中國有限公司；

細菌基因組提取試劑盒、聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)試劑盒和瓊脂糖電泳試劑盒：北京全式金生物技術有限公司；

PCR產(chǎn)物電泳凝膠回收試劑盒：美國Thermo Scientific公司；

PCR引物：100 μmol，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

生物安全柜：1300 SERIES A2型，美國Thermo公司；

恒溫培養(yǎng)箱：Medcenter Einrichtungen GmbH型，德國Friocell公司；

滅菌鍋：SX-500型，日本Tomy Digital Biology公司；

超微量分光光度計：NanoDrop 2000c型，美國Thermo公司；

離心機：5424型，德國Eppendorf公司；

單道可調量微量移液槍：Research Plus型，德國Eppendorf公司；

水平核酸電泳系統(tǒng)：Mini-Sub cell GT型，美國Bio-rad公司；

凝膠成像系統(tǒng)：Criterion Stain Free型，美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 徒手接觸雞肉的模擬和取樣 參考Zapka等[16]的方法對冷鮮雞生產(chǎn)加工和消費初加工中操作人員徒手接觸雞肉的過程進行模擬和取樣，具體修改：6位操作者均用洗手液充分洗手2 min并沖凈后，用75%酒精棉擦拭手掌，然后用涂抹棒翻轉充分擦拭手心5 cm×5 cm區(qū)域后，放入10 mL緩沖蛋白胨水溶液，反復震蕩，獲得第1份手心細菌懸濁液樣品，編號為WH-1，WH-2，…，WH-6。6位操作者分別徒手各抓取1份冷鮮雞樣品(第1位操作者抓取雞肉樣品A，第2位抓取B，以此類推)，并一直保持手掌與肉接觸并揉搓2 min后，再次用涂抹棒擦拭手心，獲得第2份手心細菌懸濁液樣品，編號為MP-1，WP-2，…，MP-6。

1.2.2 手部ART菌的分離和計數(shù) 參考Huang等[17]的方法對四環(huán)素耐藥菌(TETr)和磺胺甲惡唑/甲氧芐啶耐藥菌(SULr)進行分離：手心細菌懸濁液原液經(jīng)10倍稀釋后，用移液槍吸取1 mL原液及各稀釋液，均勻涂布于含有CYC+TET或CYC+SUL+TRI的BHI平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h。手心細菌懸濁液原液的平板培養(yǎng)物用于菌群多樣性分析，分離出單菌落的平板用于菌落計數(shù)。所有處理重復3次。參考美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)[18]對四環(huán)素或磺胺甲惡唑/甲氧芐啶耐藥折點的規(guī)定，將培養(yǎng)皿中TET、SUL和TRI的濃度點分別定為16，76，4 μg/mL；所有平板中CYC的濃度均為100 μg/mL。

1.2.3 DNA提取及PCR擴增 刮取原液培養(yǎng)皿上所有菌體，用2 mL生理鹽水重懸，混勻，取100 μL菌懸液提取細菌總DNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量儀分析確認DNA的提取質量后，使用帶 Barcode的特異引物對16S rDNA的V3-V4區(qū)進行PCR擴增。上游引物為341F：5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’，下游引物為806R：5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’。用2%瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量儀檢測PCR擴增產(chǎn)物的質量，委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司利用單端測序(Single-End)的方法，基于IonS5TMXL測序平臺[19]，對構建的小片段文庫進行高通量測序。

1.2.4 高通量測序數(shù)據(jù)分析 將下機數(shù)據(jù)導出fastq文件，根據(jù)barcode序列區(qū)分各個樣本的數(shù)據(jù)，嵌合體過濾后得到用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)[20]。用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001)以97%的一致性對所有樣本的有效標簽進行操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)的聚類[21]，用SILVA132(http://www.arb-silva.de/)的SSU rRNA數(shù)據(jù)庫[22]在界、門、綱、目、科、屬和種7個水平進行物種注釋分析。進而，用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算物種數(shù)指數(shù)(Observed species)、超指數(shù)(Chao1)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、辛普森指數(shù)(Simpson)和菌群覆蓋度指數(shù)(Goods coverage)等α-多樣性指數(shù)，評估樣品的復雜度，生成各分類水平下各類細菌的豐度[19]。其中，Observed Species指數(shù)和Chao1指數(shù)反映了樣品的菌群豐度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映了樣品的菌群多樣性，Goods Coverage指數(shù)反映了測序深度。用R軟件繪制花瓣圖，獲得不同樣本的共有菌群[23]OTUs信息。

1.3 數(shù)據(jù)處理

手部ART菌的計數(shù)結果用(平均值±標準誤差)表示，用SPSS 16.0的單因素方差分析(one-way ANOVA)方法比較徒手接觸雞肉前后手部ART菌計數(shù)的差異顯著性，當P<0.05時，判斷差異顯著，否則不顯著。

2 結果與分析

2.1 菌群計數(shù)

接觸冷鮮雞肉前經(jīng)充分洗手后，用BHI培養(yǎng)基在6位操作者的手部僅檢出約11～99 CFU/cm2的細菌，未檢出TETr菌或SULr菌；與冷鮮雞接觸后，操作者手部的兩種ART菌分別顯著增加到1.14×102～2.66×106，4.80×10～3.40×105CFU/cm2(圖1，P=0.000)，說明通過直接接觸，冷鮮雞肉產(chǎn)品表面的兩類ART菌均有轉移到操作者的手部。因此，用高通量測序技術對遷移至手部的兩類ART菌進行組成的多樣性分析。

2.2 菌群多樣性分析

2.2.1 樣品復雜度 所有樣品中兩種ART菌的菌群覆蓋度指數(shù)為0.999～1.000(表1)，說明幾乎所有的目標序列都被測出，多樣性分析結果能反映樣品菌群組成的真實情況。從所有6位操作者手部ART菌樣品測序共獲得400種不同的OTUs，平均每個樣品的TETr菌和SULr菌中分別獲得159，188個OTUs。

2.2.2 菌群結構 在門水平上，ART菌中豐度最高的3個門均為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)；在屬水平上，TETr菌和SULr菌中各注釋出79，97種已明確屬名的屬。與冷鮮雞表面細菌的主要菌屬[24-25]相比，10種主要菌屬中除了黃桿菌屬(Flavobacteriumspp.)未在試驗涉及的手部細菌樣品中發(fā)現(xiàn)外，其余9種均得了鑒定，再次驗證了接觸冷鮮雞后操作者手部分離到的ART菌主要來自冷鮮雞表面，同時，也間接說明了冷鮮雞表面的細菌有多種菌屬可能已具有抗生素耐藥性。此外，有研究[10-11]表明，肉桿菌屬(Carnobacteriumspp.)、腸球菌屬(Enterococcusspp.)、乳桿菌屬(Lactobacillusspp.)、乳球菌屬(Lactococcusspp.)和葡萄球菌屬(Staphylococcusspp.)等種屬的細菌較多地參與了AR基因的水平遷移，而在試驗中，上述種屬的細菌在手部分離到的兩類ART菌中均有檢出，因此有必要在今后的研究中進一步確認這幾類ART菌的手部分離株的耐藥性，并評估其參與動物源AR基因向人類共生菌遷移的風險。

字母不同表示同個樣品的同類細菌中，WH組和MP組差異顯著(P<0.05)

操作者編號檢出OUT種類數(shù)TETrSULr物種數(shù)指數(shù)TETrSULr超指數(shù)TETrSULr香農(nóng)指數(shù)TETrSULr辛普森指數(shù)TETrSULr菌群覆蓋度指數(shù)TETrSULr1157186121127130.69138.084.174.010.910.871.0001.0002162150121115125.19119.094.584.580.930.931.0001.000312722596117100.26137.753.473.110.860.791.0000.99941381399394101.26100.553.232.730.810.721.0001.0005179229128139135.67150.353.644.220.820.891.0001.0006190199131140144.94151.714.164.410.900.921.0001.000

2.2.3 共有菌群 共有菌群在6位操作者的手部細菌樣品中均有檢出，反映所有樣品的菌群組成共性[23]，推測其在冷鮮雞中普遍存在，對冷鮮雞加工操作者來說暴露風險較高?；ò陥D分析結果表明，TETr菌和SULr菌各有70種OUTs的共有菌群(圖2)，除各自的10，7個OUTs未鑒定到屬水平外，其他OUTs分屬3個門的21，19個屬(圖3)。

在冷鮮禽肉操作者手部分離到的TETr菌和SULr菌的共有菌群中，不動桿菌屬(Acinetobacterspp.)[26]、假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)[27]、沙雷氏菌屬(Serratiaspp.)[28]、變形桿菌屬(Proteusspp.)[29]、氣單胞菌屬(Aeromonasspp.)[30]、檸檬酸桿菌屬(Citrobacterspp.)[31]、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonasspp.)[32-33]、香味菌屬(Myroidesspp.)[34]、漫游球菌屬(Vagococcusspp.)[35]和巨型球菌屬(Macrococcusspp.)[36]的禽源分離株已被證實具有多重耐藥性，且可能存在AR基因水平遷移的風險。同時，人類的臨床數(shù)據(jù)[2]表明，除氣單胞菌屬、漫游球菌屬和巨型球菌屬外，上述其他屬的細菌近十幾年來的檢出率呈上升趨勢，且具有多重耐藥性，其中的鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)更是已成為中國目前最主要的“超級細菌”[37]。而氣單胞菌也可導致人類腸道感染，是中國夏季腹瀉的常見病原菌之一[38]；河流漫游球菌與人類感染有關[39]。因此，應特別注意這些在雞和人類中都能分離到的ART菌，禽源和人源分離株之間是否存在AR基因遷移的可能需要進一步深入研究和確認。

圖2 手部TETr菌和SULr菌中共有和特有OTUs數(shù)的花瓣圖

圖3 TETr菌共享菌群和SULr菌共有菌群的組成

除了上述菌屬，試驗中冷鮮雞肉加工操作者手中發(fā)現(xiàn)的共有TETr菌和SULr菌中的布丘氏菌屬(Buttiauxellaspp.)、叢毛單胞菌屬(Comamonasspp.)、摩根氏菌屬(Morganellaspp.)、普羅維登斯菌屬(Providenciaspp.)、假蒼白桿菌屬(Pseudochrobactrumspp.)、莫勒菌屬(Moellerellaspp.)、Koukoulia屬、穩(wěn)桿菌屬(Empedobacterspp.)、Soonwooa屬、Sulfuricurvum屬、肉桿菌屬、庫特氏菌屬(Kurthiaspp.)、魏斯氏菌屬(Weissellaspp.)和賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillusspp.)等菌屬的禽源耐藥菌株和耐藥特性尚未見報道，需要在后續(xù)的研究中對相應的菌株進行分離和驗證。

試驗利用高通量測序技術證實雞肉表面的多種TETr菌和SULr菌能通過直接接觸的途徑從冷鮮雞肉產(chǎn)品表面遷移至操作者手上，但因為兩類ART菌的獲得仍基于選擇性培養(yǎng)基的篩選，而不同的培養(yǎng)參數(shù)均會影響細菌的分離結果[40]，因此，單一的培養(yǎng)條件會限制微生物多樣性分析結果的全面性，冷鮮雞產(chǎn)品中能通過直接接觸向人類遷移的ART菌的種屬，還需配合其他培養(yǎng)方法或開發(fā)不依賴于培養(yǎng)的分析技術進行完善。此外，盡管人類皮膚暴露于各種環(huán)境下，但皮膚微生物群落仍傾向于保持一定的穩(wěn)定性[41]，通過直接接觸而遷移到人類手部的動物源ART菌能在手部皮膚表面定殖時間，以及從人類手部有效地去除這些動物源ART菌的方法值得進一步研究。

3 結論

試驗通過模擬冷鮮雞生產(chǎn)加工和消費初加工中操作人員徒手接觸雞肉的過程，用選擇性培養(yǎng)、菌落計數(shù)和菌群多樣性分析等方法，證實了TETr菌和SULr菌兩類ART菌在直接接觸中能從冷鮮雞肉產(chǎn)品表面遷移至操作者手部。其中的不動桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、變形桿菌屬、氣單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、香味菌屬和漫游球菌屬的禽源和人源分離株已被多次證實具有多重耐藥性，因此，應充分重視冷鮮雞肉表面細菌的抗生素耐藥性問題，并深入研究AR基因在上述禽源和人源細菌間水平遷移的潛在風險；共有菌群中的布丘氏菌屬等14種菌屬的禽源耐藥株的耐藥特性應進一步確認，其污染來源和遷移風險有待揭示。