周萬海，楊立艷，李苗，黃金鳳，梁玉娟，王鑫，羅思燦，魏琴*，劉洋*

1(宜賓學(xué)院，香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點實驗室，四川 宜賓，644000)2(北京科技大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，北京，100083)

植物內(nèi)生細(xì)菌是指一定時間或全部時間定殖于植物體內(nèi)對宿主無明顯不利影響的細(xì)菌[1]，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分。近年來，人們已經(jīng)從水稻[2]、葡萄[3]、巨菌草[4]等不同生境的多種植物分離獲得大量內(nèi)生細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的植物體內(nèi)都存在內(nèi)生細(xì)菌，這些內(nèi)生菌在與宿主共生過程中，可通過為宿主植物提供所需的部分營養(yǎng)物質(zhì)和激素來調(diào)控植物的生長發(fā)育[5-6]，亦可合成和分泌部分抗菌素和酶等活性物質(zhì)進而增強植物對環(huán)境的適應(yīng)能力[7-8]。同時還廣泛參與宿主次生代謝產(chǎn)物的合成與轉(zhuǎn)化，對宿主植物的種群結(jié)構(gòu)、生存、進化和健康狀態(tài)產(chǎn)生重大影響[9]；植物內(nèi)生細(xì)菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、天然產(chǎn)物合成、生物醫(yī)藥、發(fā)酵工程、環(huán)境保護和生物防治等方面有巨大應(yīng)用潛力[10]，已成為研究的熱點。

作為食品添加劑家族重要成員的香料香精在食品工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著難以估量的作用，然而近些年來食品安全問題受到空前關(guān)注，符合“綠色”要求的天然香料香精的需求不斷上升，與之相關(guān)研究也非?；钴S[11]。油樟(Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble) N. Chao)是樟科樟屬常綠喬木植物，為我國特有的產(chǎn)天然芳香油的主要樹種之一，其體內(nèi)富含的1,8-桉葉油素、松油烯-4-醇、α-松油醇等重要化學(xué)成分，是生產(chǎn)香料香精、食品、調(diào)味品的重要原料，在醫(yī)藥制品、食品添加劑、日用化工的生產(chǎn)中具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[12]。位于四川省南部的宜賓市，油樟種植面積已超過50萬畝，占全國油樟總資源的75%以上，且與同屬植物種相比，宜賓油樟芳香油含量更高，約為廣東、江西、臺灣等省油樟含芳香油量的2.5倍，這可能與其共生微生物等特殊環(huán)境條件有關(guān)[13]，大量研究證實由于宿主植物(基因型)的差異及受分布地域、溫度、濕度、季節(jié)變化、氣候條件等環(huán)境因素影響，植物內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量和種類存在豐富多樣性[14]，且在不同宿主及不同器官的種類、數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和多樣性等方面存在較大的差異[15]。特別是一些高樹齡的植物、在特殊環(huán)境下生存的植物和未受人為活動干擾的地區(qū)可能蘊含更多的特殊內(nèi)生菌類群；宜賓作為全國油樟最集中的分布區(qū)域，該地區(qū)生長的油樟可能存在與其他地區(qū)、其他物種完全不同的潛在內(nèi)生菌資源。同時受植物內(nèi)生菌在次生代謝物合成和轉(zhuǎn)化的啟示，香料植物內(nèi)生菌在天然香料的合成及制備中的作用及應(yīng)用也成為研究熱點[16]。因此，分離和研究油樟內(nèi)生菌，對了解和開發(fā)本區(qū)域油樟生產(chǎn)性能極為重要；然而，目前對油樟的研究主要集中在苗木繁育、樟油提取、單體分離和提取物功能特性等方面[17-19]，關(guān)于油樟內(nèi)生菌，多集中在內(nèi)生真菌，如王濤等從油樟根莖葉中分離到104株內(nèi)生真菌，并對其抑菌性能進行分析[20]，游玲等對78株油樟內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物進行了分析[21]，馮瑞章等則對油樟內(nèi)生溶磷細(xì)菌進行了篩選和分析[22]，而對油樟內(nèi)生細(xì)菌的研究幾乎未見相關(guān)報道，因此，本研究以宜賓地區(qū)不同生長季節(jié)油樟葉為材料，采用本實驗室篩選的葉片研磨加中和劑的方法，研究葉片內(nèi)生細(xì)菌的分布情況與多樣性，以期為后續(xù)油樟內(nèi)生細(xì)菌的深度挖掘與解析宜賓油樟獨特產(chǎn)油特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

樣品采集時間分別為2018年6月、2018年9月、2018年12月和2019年3月，采樣地點為四川省宜賓市高縣月江森林經(jīng)營所油樟母本園；采樣時選取成年健康植株5株，根據(jù)隨機取樣原則，取樣的株距在30～50 m，在樹冠的上、中、下3個部位隨機采取枝條上完全展開的葉片各5片，采集后混合均勻裝入無菌封口塑料袋，立即帶回實驗室，并于采樣后24 h內(nèi)啟動樣品內(nèi)生細(xì)菌的分離。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，分離培養(yǎng)基選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(LB)、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、阿須貝氏培養(yǎng)基和卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；肉汁胨培養(yǎng)基(NA)用于內(nèi)生菌的活化和保存。

由于油樟葉片含有大量黏性物質(zhì)，嚴(yán)重抑制內(nèi)生菌的分離，本研究根據(jù)前期實驗結(jié)果，采用中和劑處理研磨葉片，其配方為：0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甘氨酸，3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))卵磷脂吐溫80，磷酸緩沖溶液pH 7.2。

Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、細(xì)菌的16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)、PCR反應(yīng)試劑，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和提供。

1.3 油樟葉片表面滅菌

挑選采集樣本中無病變、品相良好的油樟葉片5～10 g，先用流水沖洗1～2 h，無菌水沖洗干凈后，用70%乙醇浸泡2 min，再用3%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，最后用無菌水沖洗4次。取最后1次沖洗液0.1 mL涂布到LB培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，檢測表面消毒效果。

1.4 內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化

油樟葉內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性研究采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)，取1.0 g消毒后的材料置于無菌研缽中磨成粉末(加入5 mL無菌水和4 mL中和劑混合研磨成勻漿)，采用梯度稀釋法制備1×10-1～1×10-3g/mL的系列稀釋液，每一梯度稀釋液分別取0.2 mL涂布于LB、TSA、阿須貝氏培養(yǎng)基和卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，待培養(yǎng)基中長出的菌落數(shù)平穩(wěn)后，根據(jù)各平板上菌落的形態(tài)(大小、顏色、形狀、表面光澤度、透明度、邊緣整齊度等)隨機挑取具有代表性單菌落[23]，純化編號后4 ℃保存于NA斜面上備用。根據(jù)菌落數(shù)計算每克葉片中的內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)，同時利用新復(fù)極差法進行顯著性分析。

1.5 內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列分析

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(生工生物)提取細(xì)菌基因組DNA。采用通用引物27F和1492R擴增16S rDNA。PCR反應(yīng)體系(25 μL): Taq PCR Master Mix(2x)12.5 μL、DNA模板1 μL、正向引物(10 μmol/L)1 μL、反向引物(10 μmol/L)1 μL、ddH2O補足至25 μL；PCR反應(yīng)條件：94 ℃、4 min、30個循環(huán)，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、90 s，72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。擴增產(chǎn)物切膠純化后送上海生工生物進行序列測定，將所有序列信息提交到NCBI，測序得到的結(jié)果在EzTaxon server 2.1進行比對,確定與已知序列同源關(guān)系，比對后序列相似性達(dá)到98.65%以上的歸為同一個運算的分類單位(operational taxonomic units，OTU)，并將代表菌株序列信息提交到GenBank并獲得登錄號。同時選擇和下載近緣種序列，用MEGA 6軟件Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[24]。

1.6 內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同季節(jié)油樟葉片可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌量變化

平板分離計數(shù)結(jié)果顯示，不同季節(jié)油樟葉可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)存在顯著差異，夏季油樟葉內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)為1.4×103CFU/g，而冬季油樟葉中內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)為0.7×103CFU/g，顯著低于夏季油樟葉(P<0.05)，是內(nèi)生菌豐度最低的生長階段；油樟葉內(nèi)生菌的豐度最大值出現(xiàn)在秋季，達(dá)到4.5×104CFU/g，其次為春季的1.65×104CFU/g，二者之間存在顯著差異，但都顯著高于夏季和冬季。

2.2 不同季節(jié)油樟葉片中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌分子鑒定

對傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法獲得的全部菌株通過形態(tài)觀察，最終挑取166株細(xì)菌進行16S rDNA序列的測定，通過在相關(guān)公共數(shù)據(jù)庫中進行相似性搜索，并調(diào)出相關(guān)典型菌株的有效序列，用相關(guān)軟件進行序列比對、相似性計算、進化距離矩陣計算、聚類分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建(圖1～圖4)。將代表菌株序列信息提交到GenBank并獲得登錄號。

挑取的166株內(nèi)生細(xì)菌中，春夏秋冬4個季節(jié)分別有94、56、10和6株，對應(yīng)有23、4、11和2個OTU(表1～表4)，表明不同季節(jié)油樟葉可培養(yǎng)內(nèi)生菌的數(shù)量和OTU數(shù)目發(fā)生顯著變化，其中春季油樟葉OTU數(shù)目最多，秋季油樟葉的OTU數(shù)目次之，而冬季油樟葉的OTU數(shù)目最少，僅為2個。

春季油樟葉分離的94株內(nèi)生細(xì)菌隸屬于3門9屬(圖1)，其中變形菌門(Proteobacteria)有不動桿菌(Acinetobacter)，假單胞菌(Pseudomonas)和鞘酯單孢菌(Sphingomonas)3個屬，厚壁菌門(Firmicutes)有葡萄球菌(StaphyLococcus)、芽孢桿菌(Bacillus)，氣球菌(Aerococcus)和賴氨酸芽孢桿菌(LysinibaciLLus)4個屬；放線菌門(Actinobacteria)僅有考克氏菌(Kocuria)和羅氏菌(Rothia)2個屬。春季油樟葉中的優(yōu)勢種為Bacillusamyloliquefaciensstrain YC16 (MK713569.1)，共計51株，豐度達(dá)到56.1%(表1)。

圖1 基于16S rDNA序列構(gòu)建的春季油樟葉內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree of endophyticbacteria in Cinnamomum longepaniculatum (Gamble)N. Chao leaves at spring based on 16S rDNA gene sequences

夏季油樟葉分離的10株內(nèi)生細(xì)菌分別隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)的葡萄球菌屬(Staphylococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、微桿菌屬(Microcoli)和微球菌屬(Micrococcusgenera)(圖2)，Microbacteriumresistensstrain PL-24(MK517595.1)為第一優(yōu)勢種，第二和第三優(yōu)勢種分別為Bacillussp. (in:Bacteria)strain H2(MK704289.1)和Micrococcussp. strain MRDDd(MK578275.1)，Staphylococcusnepalensisstrain MFB1(MK602316.1)為第4優(yōu)勢種(表2)。

表1 春季油樟葉內(nèi)生細(xì)菌分布Table 1 Distribution of endophytic bacteria in Cinnamomum longepaniculatum(Gamble) N. Chao leaves at spring

續(xù)表1

類群OTU數(shù)目屬代表菌株克隆數(shù)目豐度/%NCBI數(shù)據(jù)庫中相似度最高的菌種相似性/%登錄號8BacillusA605156.1Bacillus amyloliquefaciens strain YC16(MK713569.1)100MK910178A13211.1Bacillus kochii strain MER_TA_69.1 (KT719473.1)100MK910190A3622.2Bacillus simplex strain E133 (MK100910.1)100MK910172A3822.2Bacillus sp. (in: Bacteria) strainH2 (MK704289.1)100MK910173A8411.1Bacillus amyloliquefaciens strain HTI 20(MK521071.1)100MK910182A6833.3Bacillus sp. (in: Bacteria) strain DW024 (MK713577.1)100MK910180A6111.1Bacillus circulans strain PK3-56 (MG988220.1)100MK910179A5133.3Bacillus aerius strain UB02(MK696417.1)100MK9101761AerococcusA13011.1Aerococcus sp. strain InS-169(KY964258.1)100MK9101893LysinibacillusA5579.5Lysinibacillus sp. strain NT1(MH559628.1)100MK910177A10811.1Lysinibacillus sp. strain JX-5 (KX960107.1)100MK910185A10711.1Lysinibacillusmacroides strain IAE195 (MK414895.1)100MK910184Actinobacteria1KocuriaA11311.1Kocuria assamensis strain SCSIO_43735(MH283819.1)100MK9101861RothiaA10211.1Rothia sp. 3_1/4V(EF540463.1)100MK910183

表2 夏季油樟葉內(nèi)生細(xì)菌分布Table 2 Distribution of endophytic bacteria in Cinnamomum longepaniculatum(Gamble) N. Chao leaves at summer

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的夏季油樟葉內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of endophyticbacteria in Cinnamomum longepaniculatum (Gamble)N. Chao leaves at summer based on 16S rDNA gene sequences

秋季油樟葉分離的56株內(nèi)生細(xì)菌隸屬于3門5屬(圖3)，包括變形菌門(Proteobacteria)的不動桿菌屬(Acinetobacter)；厚壁菌門(Firmicutes)的芽孢桿菌(Bacillus)，葡萄桿菌(Staphylococcus)和病毒性桿菌(Virgibacillus)3個屬，擬桿菌門(Bacteroidetes)僅1個屬為金桿菌屬(Chryseobacterium)(表3)。其中Bacillussiamensisstrain TSS18(MF620076.1)和Bacilluscereusstrain X-7(MF988730.1)為并列第1優(yōu)勢種，Bacillussubtilisstrain HZ-72(MF136610.1)為第2優(yōu)勢種。

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建的秋季油樟葉內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of endophyticbacteria in Cinnamomum longepaniculatum (Gamble)N. Chao leaves at autumn based on 16S rDNA gene sequences

表3 秋季油樟葉內(nèi)生細(xì)菌分布Table 3 Distribution of endophytic bacteria in Cinnamomum longepaniculatum(Gamble) N. Chao leaves at autumn

冬季油樟葉分離的6株內(nèi)生菌均隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)芽孢桿菌屬(Bacillus)(圖4)，其第1優(yōu)勢種為Bacillusaltitudinisstrain LZLJ004(KR018737.1)，豐度達(dá)83.33%，第2優(yōu)勢種為芽孢桿菌屬(Bacillus)為Bacillussubtilisstrain JPC-2(EU1 53188.1)，豐度為16.67%(表4)。

圖4 基于16S rDNA序列構(gòu)建的冬季油樟葉內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree of endophyticbacteria in Cinnamomum longepaniculatum (Gamble)N. Chao leaves at winter based on 16S rDNA gene sequences

表4 冬季油樟葉內(nèi)生細(xì)菌分布Table 4 Distribution of endophytic bacteria in Cinnamomum longepaniculatum (Gamble) N. Chao leaves at winter

此外由以上分析可知，油樟葉中可培養(yǎng)內(nèi)生菌的數(shù)量和種類均表現(xiàn)為春、秋兩季較豐富，冬、夏兩季較單一，且4個季節(jié)油樟葉中內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢種發(fā)生顯著變化，但第1優(yōu)勢種的屬不變，都為芽孢桿菌屬(Bacillus)(圖5)。

圖5 不同季節(jié)油樟葉可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌種類豐度變化Fig.5 Relative abundance of endophytic bacteriumgenera in Cinnamomum longepaniculatum(Gamble) N. Chao leaves at different seasons

2.3 不同季節(jié)油樟葉片中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性

量化的多樣性指數(shù)可反映植物生長過程中內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)的演替變化規(guī)律，如物種豐富度(S)是衡量物種多樣性的最直接也是最重要的尺度；Shannon-Wienner指數(shù)(H)可以解釋物種的豐度和均勻度，也可以解釋物種的多樣性，物種數(shù)量越多，分布越均勻，其數(shù)值越大；Simpso指數(shù)(D)表示該群落優(yōu)勢度的統(tǒng)計量，其值越大表明群落的優(yōu)勢種越明顯，它隨一個或幾個物種優(yōu)勢度的增加而增加;群落組成的數(shù)量及空間分布的不同，形成群落的結(jié)構(gòu)格局[27]。油樟生長過程中不同季節(jié)葉內(nèi)生細(xì)菌的豐富度和多樣性指數(shù)見表5，由表5可以看出，在4個不同季節(jié)油樟葉中，物種豐富度指數(shù)和Shannon-Wienner指數(shù)值反映出基本一致的多樣性趨勢，其變化分別為2～23和0.11～2.00，變化較為劇烈，但都表現(xiàn)為春季最大，冬季最小；不同季節(jié)油樟葉可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌Simpson指數(shù)值變化也極為劇烈，其中秋季值最大，冬季值最??；而不同季節(jié)油樟葉內(nèi)生細(xì)菌均勻度指數(shù)的變化在0.15～0.92，表現(xiàn)為夏季>秋季>春季>冬季，由此可見，春季油樟葉中內(nèi)生細(xì)菌群落的物種數(shù)最多，多樣性最為豐富，秋季次之，而冬季油樟葉內(nèi)生細(xì)菌群落的物種數(shù)最少，多樣性也最低。

表5 不同季節(jié)油樟葉中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)Table 5 Diversity of endophytic bacteria in Cinnamomum longepaniculatum(Gamble) N. Chao leaves at different seasons

3 討論

內(nèi)生菌是影響植物生長發(fā)育和產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素，是潛力巨大且尚待開發(fā)的微生物新資源[14]。為了得到能夠用于純培養(yǎng)并能進一步研究、應(yīng)用的植物內(nèi)生細(xì)菌，本研究采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法首次對不同季節(jié)油樟葉中內(nèi)生細(xì)菌進行分離、純化及鑒定。在獲得大量微生物資源的同時，也發(fā)現(xiàn)油樟葉內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量隨季節(jié)變化，其值在0.7×103～4.5×104CFU/g，該結(jié)果與多數(shù)植物葉片組織內(nèi)生細(xì)菌含量相當(dāng)[3]。油樟葉內(nèi)生菌的數(shù)量秋季最高，春季次之，冬季則最低，究其原因，可能與油樟葉在當(dāng)季獨特的生理特征有關(guān)[28]；一些研究指出，隨植物生長發(fā)育階段變化的物質(zhì)代謝會影響植物內(nèi)生細(xì)菌群落數(shù)量和結(jié)構(gòu)特征[4]，特別是在旺盛生長階段，大量而又豐富的糖、蛋白等物質(zhì)為不同內(nèi)生菌的生長發(fā)育提供了足夠底物[29]。本研究中，春季是油樟生長量最大的季節(jié)，而秋季則是油樟葉含油量最高階段，此兩階段是油樟葉器官中物質(zhì)代謝最為旺盛和活躍階段，豐富的底物是其內(nèi)生菌數(shù)量和種類最多的原因；而在夏季和冬季內(nèi)生菌數(shù)量和種類極少，可能與本區(qū)域夏季高溫干旱和冬季低溫寡日照等因素導(dǎo)致油樟生長減緩有關(guān)。進一步的，本研究中油樟中可分離培養(yǎng)內(nèi)生菌數(shù)量較多的季節(jié)與其生長最旺和功能物質(zhì)產(chǎn)量最高階段顯著相關(guān)，又因為內(nèi)生菌與宿主植物生長和有效成分合成有關(guān)，進而可以通過對內(nèi)生菌的篩選而得出有效成分含量較高的植物生長階段，從而提高植物的利用率。

分離物數(shù)量多少會直接影響對多樣性的研究，而植物內(nèi)生菌群落組成極其復(fù)雜，采用傳統(tǒng)平板法分離的微生物只能占到總數(shù)的0.1%到10.0%，不能充分反映微生物群落結(jié)構(gòu)[30]。消毒方法、材料處理方法、培養(yǎng)基等是影響內(nèi)生菌分離的重要因素[31]。本研究在分離時盡管采用了LB、TSA、阿須貝氏培養(yǎng)基和卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂等前期篩選的培養(yǎng)基，力求最大限度地分離油樟葉中的內(nèi)生細(xì)菌，但這些培養(yǎng)基與內(nèi)生菌自然生長條件仍有較大差別，進而造成某些微生物的富集生長，而另一些微生物缺失，導(dǎo)致部分內(nèi)生細(xì)菌資源遺漏。此外，我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，由于油樟葉中大量的黏液導(dǎo)致接種后幾乎不能分離出內(nèi)生細(xì)菌，本研究中一個重大的改進是采用中和劑處理研磨葉片，該方法能較好地中和油樟葉中的黏液，促進內(nèi)生菌的釋放；因此為分離獲得油樟葉中更多的內(nèi)生細(xì)菌資源，更全面地獲取油樟內(nèi)生細(xì)菌的信息，后期還應(yīng)進一步優(yōu)化分離、培養(yǎng)技術(shù)。

原核生物的16S rDNA序列含有保守序列和可變序列，保守序列反應(yīng)物種的親緣關(guān)系為系統(tǒng)發(fā)育提供線索；可變序列是每種微生物的特征序列，是鑒定種屬的分子基礎(chǔ)，在細(xì)菌的種屬分類鑒定中廣泛應(yīng)用[32]，本研究中，對從不同季節(jié)油樟葉中根據(jù)形態(tài)特征挑取的166株內(nèi)生細(xì)菌進行16S rDNA鑒定后共獲得40個OTU，歸屬于4個門13個屬，主要門類為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門，各樣品的菌群組成和豐度雖有差異，但厚壁菌門為優(yōu)勢菌群，約占 26.1%～100%。在不同季節(jié)，存在不同種類的內(nèi)生菌主要包括：不動桿菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、氣球菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬、考克氏菌屬、羅氏菌屬、微桿菌屬、微球菌屬、枝芽孢菌屬和金黃桿菌屬，其中4個季節(jié)中都有芽孢桿菌屬，且表現(xiàn)出絕對優(yōu)勢，這與前人在其他植物上的研究結(jié)果相類似[33]，表明該類菌可能在油樟與環(huán)境的互作過程中發(fā)揮著重要的作用。有文獻(xiàn)報道，芽孢桿菌屬中的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciensstrain)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等能夠產(chǎn)生和分泌不同類型的抗生素、生長素等，可廣泛用于病蟲害的生物防治，亦可改善土壤環(huán)境，提高農(nóng)作物產(chǎn)量[34]，其他類型的芽孢桿菌還具有產(chǎn)酶、分解纖維素等功能而被應(yīng)用在飼料生產(chǎn)[35]、代謝工程和合成生物學(xué)等領(lǐng)域[36]。本研究中分離到最多的芽孢桿菌也為解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，然而這些芽胞桿菌種類并不相同，由于芽胞桿菌具有高度相似的16S rDNA序列區(qū)域，后期可通過gyrA、polC和rpoB等基因來進一步鑒定芽胞桿菌屬的細(xì)菌[37]。此外本研究還分離到的不動桿菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單孢菌屬、微桿菌屬，該類菌已被其他研究人員用于醫(yī)用抗生素篩選[38]、功能活性物質(zhì)合成[39]、農(nóng)業(yè)病害防治[40]、環(huán)境保護等領(lǐng)域[41]，這些研究結(jié)果意味著，本研究分離的菌株中也極有可能存在大量未被開發(fā)利用的功能菌株，后期還需進一步對分離內(nèi)生菌進行功能篩選。

植物內(nèi)生菌生物多樣性是衡量其內(nèi)環(huán)境是否穩(wěn)定和健康的一個重要指標(biāo)，適宜的植物內(nèi)環(huán)境，其內(nèi)生細(xì)菌多樣性豐富，優(yōu)勢度低，細(xì)菌種類分布均勻[42]。大部分研究認(rèn)為內(nèi)生菌是由土壤微生物入侵后和宿主協(xié)同進化而來[43]，也可能是因為地區(qū)氣候特征及周圍植被的不同，造成大氣中的微生物組成產(chǎn)生差異進而影響宿主[44]，因此植物生長的生態(tài)環(huán)境不同，內(nèi)生菌種群結(jié)構(gòu)和分布必然會存在一定的差異，本研究中，不同季節(jié)油樟葉內(nèi)生細(xì)菌種豐富度、多樣性、均勻度、優(yōu)勢度存在顯著差異，春季油樟葉中的內(nèi)生菌多樣性最高，優(yōu)勢度和均勻度相比夏季和秋季顯著降低，而秋季油樟葉中的內(nèi)生菌優(yōu)勢度較高，但種群種類豐富度和多樣性均低于春季，這可能與同期樹體所處不同的生理狀態(tài)有關(guān)；相比較于春秋兩季，冬季油樟葉中內(nèi)生細(xì)菌豐富度、多樣性指數(shù)、優(yōu)勢度和均勻度均急劇降低，這可能是由于同期氣溫、光照及降水等環(huán)境因素造成土壤及大氣微生物種群結(jié)構(gòu)的不同，進而是油樟葉內(nèi)生菌種類向優(yōu)勢種群芽孢桿菌屬集中，有群落單一化趨勢。而夏季的高溫、強光照和干旱等環(huán)境因素，使得油樟葉內(nèi)生細(xì)菌種類也向優(yōu)勢種群芽孢桿菌屬集中，雖然豐富度急劇降低，但多樣性、優(yōu)勢度仍保持較高，均勻度則顯著升高，這可能是內(nèi)生菌對植物適應(yīng)外界環(huán)境導(dǎo)致的內(nèi)部微環(huán)境變化的一種響應(yīng)，但相關(guān)機制還應(yīng)做更進一步研究。

4 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法首次對宜賓地區(qū)天然香料植物油樟葉生細(xì)菌群落多樣性進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)油樟葉片中的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量發(fā)生顯著變化，其中秋季最高，冬季最低，根據(jù)形態(tài)特征最終從4個季節(jié)的油樟葉中挑取到166株內(nèi)生細(xì)菌，16S rDNA基因序列鑒定所得菌株可分為3個門13個屬40個種，其中春季和秋季的內(nèi)生細(xì)菌種類和數(shù)量最多，而冬季和夏季群落較為單一，數(shù)量較少，但4個季節(jié)油樟葉中優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌均為芽胞桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌，多樣性指數(shù)分析表明油樟葉中內(nèi)生細(xì)菌具有較豐富的遺傳多樣性，不同季節(jié)的種群數(shù)量、均勻度、優(yōu)勢度存在差異，秋季種類較豐富，優(yōu)勢屬突出，且分布均勻，而冬季多樣性、優(yōu)勢度和均勻度較低。本研究為進一步挖掘植物與共生內(nèi)生細(xì)菌之間的互作關(guān)系提供參考依據(jù)，可為深入研究油樟葉內(nèi)生微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)與其物質(zhì)代謝和樟油合成調(diào)控提供供試菌種資源基礎(chǔ)，進而對推進本區(qū)域油樟科學(xué)研究及樟油產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有積極的理論與實踐價值。